高效液相色譜法同時測定干菊花中五種防腐劑

周斌 楊懷燕 張秀梅 等

摘要：建立了同時測定干菊花中5種防腐劑的高效液相色譜分析方法，優化后的色譜條件為采用Waters XTerra C18色譜柱（3.9 mm×150 mm，5 μm）分離，流動相為乙酸水溶液（0.1%）/甲醇梯度洗脫，用二極管陣列檢測器在波長254 nm處進行檢測。結果表明，5種防腐劑在18 min內可獲得較好的分離效果，在0.1～20.0 mg/L范圍內線性關系良好（r≥0.999 8），檢出限為0.001 5～0.059 0 mg/L，定量限為0.005 0～0.196 8 mg/L，加標回收率為85.9%～97.8%，RSD為0.5%～12.5%。該方法操作簡單、靈敏度高、重復性好，可用于檢測干菊花中防腐劑。

關鍵詞：高效液相色譜；防腐劑；干菊花；同時測定

中圖分類號：TS207.3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）04-1013-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.04.049

Simultaneous Determination of Five Kinds of Preservatives

in Dried Chrysanthemum Using HPLC

ZHOU Bin1，YANG Huai-yan1，ZHANG Xiu-mei1，CHEN Pin-yan1，LUO Xing-hua1，YANG Jia-qin2，YANG Zhi-min1

（1.Center of Test and Analysis， Institute of Soil Fertilizer and Agricultural Environment， Dali Prefecture Academy of Agricultural Sciences， Dali 671005， Yunnan，China； 2. Dali Town Service Center of Comprehensive Agricultural， Dali 671000， Yunnan， China）

Abstract： High performance liquid chromatography method was developed for the determination of five kinds of preservatives in dried chrysanthemum. The analysis were separated by a Waters XTerra C18 column（3.9 mm×150 mm，5 μm） using 0.1% of ethanoic acid and methanol as mobile phases for gradient elution.A diode array detector was used to detect at 254 nm. The results indicated that five kinds of preservatives were well separated within 18 min， linear relationship were good in the range of 0.1～20.0 mg/L （r≥0.999 8）， the values of detection limit and quantification limit were the range of 0.001 5～0.059 0 mg/L and 0.005 0～0.196 8 mg/L respectively，the recoveries at spiked levels range from 85.9% to 97.8%，the relative standard deviations（RSD） range from 0.5% to 12.5%. With the advantages of simplicity， sensitivity and repeatability， the method could meet the requirements for determination of preservatives in dried chrysanthemum.

Key words： HPLC； preservatives； dried chrysanthemum； simultaneous determination

隨著防腐劑技術的發展和提高，復合防腐劑越來越受到人們的重視。復合防腐劑是由幾種具有協同效應的防腐劑復配而成，可以克服單一防腐劑在防腐效力上的局限性，擴大抑菌范圍和效力，從而降低食品添加劑的用量，提高食用安全性[1，2]，其中山梨酸、對羥基苯甲酸酯類是目前工業中應用最廣泛的防腐劑[3]。但過量或非法的防腐劑在一定程度上危害人體健康，甚至威脅人類生命[4]。因此，防腐劑的安全性及檢測方法已成為焦點，各個國家的研究者都在努力尋求有效便捷的防腐劑檢測方法[5，6]。

菊花是別樣茶中的一個古老的品種，可以藥用，也可以食用[7]，其有很廣泛的生物活性，如抗炎、抗人類免疫缺陷病毒、抗氧化、保護心血管、抗癌、抗突變等[8-10]。隨著對外貿易的擴大，中國藥品出口量逐年增加，為保證其質量，鞏固和擴大國外市場，防腐劑含量的測定已成為重點之一。《中華人民共和國藥典》中規定，藥品中防腐劑山梨酸含量不得超過0.3%，對羥基苯甲酸酯類（p-hydroxybenzoate）不得超過0.05%[11]。目前，測定防腐劑的方法主要有液相色譜法[6，12]、氣相色譜法[13-15]、毛細管電泳法[16]等，可測定干菊花中的防腐劑未見報道。本研究選用在酸性條件下用乙醚提取，經萃取凈化，通過液相色譜法進行測試分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent Technologies 1200 Series高效液相色譜儀（G1315C-DAD；G1322A-Degasser；G1311A-Quat Pump；G1367C-Hip ALS SL；G1316B-TCC SL），Waters XTerra C18色譜柱（3.9 mm×150 mm，5 μm）；山梨酸、對羥基苯甲酸（甲、乙、丙、丁）酯標準品（純度≥99.5%，Dr.Ehrenstorfer GmbH），甲醇（色譜純，美國TEDIA公司），其他試劑均為分析純，試驗用水為二次蒸餾水。

1.2 樣品準備與處理

樣品經粉碎機粉碎，稱取0.5 g樣品于50 mL離心管中，加入10 mL 1%乙酸乙醚搖勻，進行超聲提取5 min，4 000 r/min離心5 min，將上清液轉入旋蒸瓶中，提取重復3次合并。旋蒸瓶中的提取液經旋蒸儀（40 ℃）蒸干，用1%乙酸乙醚溶解移入比色管中，水∶1%乙酸乙醚（V/V，3∶7）的萃取體系萃取3次，合并1%乙酸乙醚部分萃取液蒸干，最后用1%乙酸甲醇溶解移入容量瓶中定容至10 mL，經0.45 μm微孔過濾膜過濾，濾液供HPLC測定。

1.3 色譜條件

Waters XTerra C18色譜柱（3.9 mm×150 mm，5 μm）；流動相：甲醇和0.1%乙酸水溶液，梯度洗脫：0～5 min，40 %甲醇；5～15 min，40%～60%甲醇；15～30 min，60%～80%甲醇。流速：0.8 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測器：DAD；檢測波長：254 nm；進樣量：10 μL。

2 結果與分析

2.1 檢測波長的選擇

用二極管陣列檢測器在210～400 nm范圍內對各組分的標準溶液進行光譜掃描。結果表明，5個組分中有4個組分在256.8 nm處具有較高的靈敏度，而另1個組分在230 nm處具有較高的靈敏度，為綜合考慮檢測靈敏度，選擇254 nm作為檢測波長。

2.2 色譜條件的選擇

在參照文獻[17]選擇甲醇和0.1%乙酸水溶液為流動相，因此，對梯度洗脫程序進行優化，參照“1.3”色譜條件，5種防腐劑得到有效分離，且靈敏度較高。5種防腐劑混合標準溶液的色譜圖見圖1。2.3 提取溶劑和萃取體系的選擇

山梨酸、對羥基苯甲酸酯微溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙腈和乙醚等溶劑。分別選用甲醇、乙腈和乙醚提取溶劑進行提取比較，發現甲醇和乙腈提取液的顏色要比乙醚提取液的顏色要深，且通過HPLC檢測甲醇和乙腈提取物對檢測目標物干擾突出，乙醚提取物對檢測目標物干擾很小。考慮到盡可能減小干擾和提高回收率，選擇在酸性條件下提取和萃取，結果發現用1%乙酸乙醚提取，并用水∶1%乙酸乙醚（V/V，3∶7）的萃取體系萃取時，回收率可達95%以上。因此，選擇1%乙酸乙醚為提取溶劑、水∶1%乙酸乙醚（V/V，3∶7）為萃取體系。

2.4 方法的評價

2.4.1 標準曲線的線性范圍 在確定的色譜條件下對質量濃度為0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、15.0和20.0 mg/L的混合標準溶液分別進行測定，以各組分的峰面積（Y）對其質量濃度（X，mg/L）進行線性回歸。結果表明，山梨酸和4種對羥基苯甲酸酯類化合物在0.1～20.0 mg/L范圍內呈良好的線性關系，相關系數均大于0.999 8，回歸方程見表1。

2.4.2 檢出限和定量限 根據儀器檢出限限量的要求，連續測定最低濃度標準溶液20次，求出相對偏差（SA），工作曲線的斜率為靈敏度（S）。3SA/S為檢出限，10SA/S為定量限，結果見表2。

2.4.3 準確度和精密度 將配置好的混合標準溶液按“1.3”色譜條件，對3個濃度連續測定6次，按峰面積計算。RSD均在2.49%以下，結果表明儀器精密度良好，測定結果見表3。

2.4.4 加標回收率試驗 以未加防腐劑的樣品為空白，分別加入兩個不同濃度水平的防腐劑混合標準溶液適量，進行加標回收試驗，回收率結果見表4。回收率在85.9%～97.8%，RSD在0.5%～12.5%，具有理想的回收率。

3 結論

結果表明，使用高效液相色譜法對干菊花中山梨酸、4種對羥基苯甲酸酯同時檢測，樣品加標回收率在85.9%～97.8%之間，線性系數r≥0.999 8，檢出限為0.001 5～0.059 0 mg/L，定量限為0.005 0～0.196 8 mg/L，能夠滿足樣品中防腐劑殘留量的分析要求。

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