1株膿腫分枝桿菌臨床分離株的鑒定

郭素芳,王俊瑞,范文兵,王艷艷,劉超梅

(1.內蒙古醫科大學附屬醫院檢驗科,呼和浩特 010050；2.解放軍第二五三醫院感染控制科，呼和浩特 010051)

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·個案與短篇·

1株膿腫分枝桿菌臨床分離株的鑒定

郭素芳1,王俊瑞1,范文兵1,王艷艷1,劉超梅2△

(1.內蒙古醫科大學附屬醫院檢驗科,呼和浩特 010050；2.解放軍第二五三醫院感染控制科，呼和浩特 010051)

膿腫分枝桿菌； 菌種鑒定； 16S rRNA

膿腫分枝桿菌是一種不產色素的快速生長的分枝桿菌，與龜分枝桿菌親緣關系較近。在快速生長的分枝桿菌引起的疾病中，60%～80%的慢性肺病由該菌導致，該菌也是引起創傷后傷口感染的主要病原體。在我國有膿腫分枝桿菌造成肺部病變和軟組織損害的報道[1-3]。

1 資料與方法

1.1 一般資料 患者，男，74歲。因氣短、咳嗽咳痰20余年，加重5 d，發熱體溫38.5 ℃伴有寒戰，咳黃色黏痰入院。胸腹CT顯示有肺炎，雙側胸腔積液，左側加重并局部包裹，左肺下葉壓縮性肺不張，肝右葉小囊腫，盆腔少量積液。胸腔置管引流出黃色膿性積液1 000 mL,送檢進行常規、生化及一般細菌培養。培養6 d有革蘭陽性球菌生長，抗酸染色陽性，疑似非結核分枝桿菌。

1.2 儀器與試劑 PCR儀(伯樂公司)；電泳儀、凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)；血平皿購自天津金章公司。沙保羅培養基用英國OXOID公司干粉自配；聚合酶鏈反應(PCR)擴增引物試劑由上海生工合成，聚合酶(Ex Taq DNA Polymerase，TAKARA)。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 菌株DNA 嚴格提取按照試劑盒說明書進行，試劑盒由天根有限公司提供。收集沙保羅培養基上的新鮮培養物5～6 環，采用20 mg/mL溶菌酶作用30 min，蛋白酶K 及RNase A 破除細胞壁，去除蛋白、RNA 等物質，最后使用TE 溶解DNA 沉淀，-20 ℃保存備用。

1.3.2 產物PCR擴增 反應體系：1 μL模板，1 μL 引物F，1 μL引物R，12.5 μL聚合酶(Ex Taq DNA Polymerase，TAKARA)，9.5 μL dd H2O。16S rRNA 基因序列引物由上海生工合成提供。16S rRNA-27F：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′；16S rRNA-1492R,5′-ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT-3′。PCR 反應條件：94 ℃，5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min，共35個循環；72 ℃，7 min。反應結束后其產物進行瓊脂糖凝膠電泳，條件為1%的瓊脂糖含1 μg/mL EB，緩沖液為1×TBE，電泳為100 V/cm 約30 min。相對分子質量標志使用DL 2000 Marker，結果分析使用凝膠圖像分析系統。

1.3.3 PCR及分子測序技術及序列比對 PCR 產物的基因測序由上海生工基因科技有限公司完成，并與公共數據庫(GenBank database,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進行DNA 序列同源性比較，確定菌種類型。

2 結 果

2.1 培養鑒定 胸腔積液標本接種至血平皿、麥康凱平皿35 ℃、5% CO2培養，培養48 h血平皿、麥康凱平皿上均無肉眼可見的細菌生長。取血平皿原始接種區培養物涂片革蘭染色，顯微鏡下見少量非常小的革蘭陽性球菌,散在和串珠樣排列，疑為慢性生長菌。轉種血平皿繼續培養4 d，轉種血平皿可見直徑約1 mm、灰黃色、圓形、光滑、邊緣整齊且不溶血的大小相同的小菌落，麥康凱平皿上未見生長。涂片革蘭染色陽性桿菌呈索條狀，抗酸染色陽性，疑似快生長非結核分枝桿菌。見圖1。

注：A 表示轉種培養后抗酸染色；B 表示轉種培養后革蘭染色。

圖1 菌株的培養鑒定

圖2 16S rRNA 片段的PCR 擴增

圖3 菌株16S rRNA 基因序列比對分析

2.2 DNA提取和PCR擴增 取沙保羅培養基上生長對數期菌落，抽提菌株DNA；PCR 擴增16S rRNA 基因序列，1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，16S rRNA PCR 擴增產物大小約1 500 bp。見圖2。

2.3 測序分析 對其PCR 產物進行測序并與http:blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi進行DNA 序列同源性比較，測序結果與膿腫分枝桿菌同源性達90%。見圖3。

3 討 論

膿腫分枝桿菌為一種非結核分枝桿菌，該菌廣泛存在于自然界，人和某些動物均可感染致病，至今尚未發現動物傳染人或人與人直接傳染的證據[4-5]。近年來，膿腫分枝桿菌引起人感染的報道越來越多，慢性呼吸道疾病患者是其易感人群[6]。本實驗菌株來源于肺炎患者的胸腔積液，培養48 h未見細菌生長。因送檢胸腔積液呈膿性且涂片可見大量的白細胞，故取原始接種區涂片革蘭染色見少量革蘭陽性球菌。繼續培養4 d可見針尖大小菌落，因此對疑似細菌感染標本如培養48 h未見細菌生長時，認為取原始接種區標本涂片革蘭染色鏡檢可避免一些慢性生長菌漏檢。本研究膿腫分枝桿菌轉種血平皿培養4 d可見菌落灰黃色，且隨培養時間延長，顏色逐漸加深，與桂靜等[7]報道一致。

傳統菌種鑒定方法耗時長且準確性差，不能鑒定到種,同時要求實驗人員對觀察結果的判定具備高度的專業知識，才能得到可靠的結果。近年來，一些基于分子生物學的菌種鑒定方法已廣泛使用，極大地提高了對該菌種鑒定的診斷水平[8]。PCR具有特異性和敏感性高、快速、簡便、重復性好及易自動化等優點。PCR和DNA堿基序列測序技術迅速發展，對16S rRNA基因進行測序并與基因序列進行比對，可將分枝桿菌鑒定至種，成為鑒定分枝桿菌菌種的金標準[9-10]。

臨床表現及病理等方面表明，非結核分枝桿菌和結核分枝桿菌感染還是比較難以區別，在無菌種鑒定結果情況下，可能長期被誤診為結核病。由于其對常見的抗結核藥物大多耐藥，給臨床治療帶來很大困難，故準確鑒別兩者具有重要的臨床意義[11]。該菌對抗結核藥物天然耐藥，不同菌種對藥物敏感性也不相同，治療方案與療程應根據菌種而定[12-13]。因此，快速、準確地鑒定分枝桿菌菌種對于疾病診斷、治療和控制具有重要的臨床價值。

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10.3969/j.issn.1673-4130.2016.20.066

C

1673-4130(2016)20-2944-02

2016-03-16

2016-05-21)

△通訊作者，E-mail：chaomei253@sina.com。