2型糖尿病患者糖原合成酶激酶3β的表達及活性

譚 婕，吳建華，王江平，鄒俊清，明安萍

(1.湖北中醫藥大學附屬湖北省中醫院檢驗科，武漢 430061；2.湖北省中醫院檢驗科，武漢 430061)

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·論 著·

2型糖尿病患者糖原合成酶激酶3β的表達及活性

譚 婕1，吳建華2△，王江平2，鄒俊清2，明安萍2

(1.湖北中醫藥大學附屬湖北省中醫院檢驗科，武漢 430061；2.湖北省中醫院檢驗科，武漢 430061)

目的 探討糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)在2型糖尿病患者和健康者外周血單個核細胞中的蛋白表達及活性水平。方法 運用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測30例2型糖尿病血糖未控制患者(實驗1組)、30例2型糖尿病血糖控制患者(實驗2組)和30例健康者(健康對照組)外周血單個有核細胞GSK-3β蛋白表達及活性水平，并分析其結果。結果 2型糖尿病患者GSK-3β蛋白水平比健康對照組升高(P<0.05),實驗1組GSK-3β活性水平比健康對照組和實驗2組升高(P<0.05)；實驗2組GSK-3β蛋白水平比健康對照組升高(P<0.05)。實驗1組男性GSK-3β活性水平比健康對照組男性升高(P<0.05)。結論 2型糖尿病患者GSK-3β蛋白高表達。經藥物治療后血糖控制者GSK-3β蛋白仍高表達，但活性水平明顯下降。2型糖尿病血糖未控制男性患者GSK-3β活性水平明顯增高。

2型糖尿病； 外周血單個核細胞； 糖原合成酶激酶3β

糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)是一種遺傳保守的絲氨酸/蘇氨酸類蛋白激酶，可調控基因轉錄、細胞周期代謝、細胞凋亡、腫瘤發生等[1-3]。目前已知GSK-3β是細胞內胰島素、生長因子等多種信號途徑的交匯點，具有廣泛的底物(包括多種轉錄因子)，參與多種信號的負調控[2-4]。GSK-3β在機體的表達可能會影響到胰島素細胞信號的轉導，因此其在2型糖尿病患者體內的異常表達成為研究2型糖尿病發病機制的一個重要標志物。現采用ELISA法檢測2型糖尿病患者外周血單個核細胞GSK-3β蛋白表達及活性，探討其與2型糖尿病患者病情變化的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2015年5～10月就診于該院并經生化檢查結合臨床癥狀確診為2型糖尿病的患者60例，符合世界衛生組織(WHO)糖尿病專家委員會提出的診斷及分型標準(1999)。根據血糖控制情況分為2組，實驗1組為血糖未控制患者，共30例，男15例，女15例，平均年齡61.2(47～77)歲；實驗2組為血糖控制者，共30例，男15例，女15例，平均年齡57.5(26～83)歲。健康對照組為該院體檢中心的體檢健康者，共30例，男15例，女15例，平均年齡55.7(26～86)歲，無糖尿病史。排除糖尿病急性并發癥，心、肝、肺及非糖尿病性神經病變等急性發作者，急、慢性感染，惡性腫瘤等。所有研究對象均清晨抽取空腹靜脈血，EDTA抗凝血2 mL，肝素抗凝血2 mL，采用肝素抗凝血做相關生化檢查，使用EDTA抗凝血做糖化血紅蛋白檢測，在采血4 h內從剩余的EDTA抗凝血中提取外周血單個有核細胞。3組研究對象的年齡、性別等一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

1.2 方法

1.2.1 標本處理 吸取EDTA抗凝血1 mL，使用Solarbio公司的人外周血淋巴細胞分離液提取人外周血單個核細胞，約取2×106個細胞，使用Solarbio公司的白細胞裂解液充分裂解淋巴細胞，把吹打之后的液體轉移至EP管中，于-60 ℃冰箱保存，備用。

1.2.2 ELISA法檢測 采用 ELISA 雙抗體夾心法對標本中GSK-3β蛋白及活性水平進行定量分析。操作步驟嚴格按武漢華聯科生物科技有限公司提供的試劑盒使用說明書進行。使用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度(OD值)，通過標準曲線計算樣品中人GSK-3β蛋白及活性水平。

表1 3組研究對象的一般資料結果比較±s)

2 結 果

2.1 糖尿病患者和健康者GSK-3β蛋白及活性水平結果比較 2型糖尿病患者GSK-3β蛋白水平比健康對照者升高，差異有統計學意義(P<0.05)；但GSK-3β活性水平與健康對照者比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 糖尿病患者和健康者GSK-3β蛋白及活性水平結果比較±s)

注：與健康對照組比較，*P<0.05。

2.2 3組研究對象GSK-3β蛋白及活性水平結果比較 實驗1組GSK-3β活性水平比健康對照組和實驗2組升高，差異有統計學意義(P<0.05)；實驗2組GSK-3β蛋白水平比健康對照組升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 3組研究對象GSK-3β蛋白及活性水平結果比較

注：與健康對照組比較，*P<0.05；與實驗2組比較，△P<0.05。

2.3 3組研究對象不同性別GSK-3β蛋白及活性水平結果比較 GSK-3β蛋白水平在3組不同性別者差異無統計學意義(P>0.05)。但實驗1組男性GSK-3β活性水平比健康對照組男性升高,差異有統計學意義(P<0.05)，其他組間不同性別者差異無統計學意義(P>0.05)。 見表4、5。

表4 3組不同性別者GSK-3β蛋白水平結果比較

表5 3組不同性別者GSK-3β活性水平結果比較

注：與同性別健康對照組比較，*P<0.05。

3 討 論

GSK-3β在細胞內作為眾多信號轉導通路的主要調控酶之一，可影響多種細胞的生長及凋亡，其在體內的作用各有利弊，過度激活或抑制都可能引起機體的病理改變[5]。Pearce等[6]研究發現，GSK-3β過表達對小鼠整體葡萄糖耐量具有一定的影響。一個選擇性地在骨骼肌過度表達GSK-3β亞型的小鼠模型與非轉基因對照組小鼠比較，雄性GSK-3β轉基因小鼠糖原合成酶活性和糖原水平降低。口服葡萄糖耐量實驗中，雄性GSK-3β轉基因小鼠表現出極其強烈的葡萄糖反應及胰島素水平升高，提示整體水平的胰島素敏感性降低，并表現出血脂障礙。動物模型顯示GSK-3β高表達與胰島素敏感性降低具有相關性。Satish等[7]研究報道，GSK-3β是骨骼肌中葡萄糖合酶的主要調節基因，GSK-3β可一定程度抑制2型糖尿病患者骨骼肌及肝臟中胰島素抵抗作用。凌振芬等[8]研究證實，2型糖尿病患者外周血白細胞中GSK-3β的酶活性明顯高于健康者。楊莉莉等[5]研究發現，高糖環境下足細胞GSK-3β表達量增多，足細胞單層屏障功能受損，可能是引起糖尿病腎病的重要因素之一。 綜上所述，大量的動物實驗及人體指標監測都提示GSK-3β在機體中的異常表達與高血糖密切相關。

前期實驗發現，2型糖尿病患者與健康對照者的GSK-3β基因相對表達量，差異無統計學意義(P>0.05)[9]。但本實驗結果表明，2型糖尿病患者的外周血單個核細胞GSK-3β蛋白表達量較健康對照組明顯增多(P<0.05)，但兩者的活性水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。將2型糖尿病患者分為血糖未控制組(實驗1組)和血糖控制組(實驗2組)，提示實驗1組的GSK-3β活性水平比實驗2組和健康對照組升高，差異有統計學意義(P<0.05),實驗2組的GSK-3β活性水平與健康對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。實驗2組的GSK-3β蛋白水平比健康對照組升高(P<0.05)，而與實驗1組差異無統計學意義(P>0.05)。不同組別的性別者，男性GSK-3β活性水平相對增高，尤其以實驗1組男性增高更甚，高于健康對照組男性(P<0.05)。

2型糖尿病患者GSK-3β基因并未發生結構或數量的改變，但在經過轉錄和翻譯轉變為蛋白質分子之后，出現蛋白質水平高表達。經過藥物治療后的2型糖尿病患者，血糖得到有效控制者GSK-3β蛋白水平仍高表達，但活性水平明顯下降。說明2型糖尿病治療對GSK-3β在機體的影響，更多的是其活性抑制，而對蛋白影響并不明顯。提示同時檢測GSK-3β在人外周血單個核細胞中的蛋白及活性水平有利于2型糖尿病的臨床診斷及病情發展的觀察。臨床用藥方面可考慮進一步探索抑制GSK-3β活性或蛋白合成的藥物在2型糖尿病治療中的應用。

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[7]Satish P,Bradley W.Doble A,et al.Tissue-specific role of glycogen synthase kinase 3 in glucose homeostasis and insulin action[J].Mol Cell Biol,2008,29(12):6314-6328.

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The protein expression and activity of glycogen synthase kinase 3β in the peripheral blood mononuclear cells of type 2 diabetic patients

TANJie1,WUJianhua2△,WANGJiangping2,ZOUJunqing2,MINGAnping2

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,AffiliatedHubeiProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine，Hubei430061,China；2.DepartmentofClinicalLaboratory，HubeiUniversityofChineseMedicine,Wuhan，Hubei430061,China)

Objective To investigate the clinical value of observing the differences of GSK-3β protein expression and activity level in the peripheral blood mononuclear cells between type 2 diabetes mellitus patients and healthy people.Methods Using ELISA to detect the GSK-3β protein expression and activity levels of people who contained 30 patients with type 2 diabetes whose blood glucose were not controlled (test group 1),30 cases of patients with type 2 diabetes whose blood glucose were controlled (test group 2) and 30 cases of healthy human and all the data were analyzed.Results The GSK-3β protein content of Type 2 diabetes mellitus group was higher than the control group(P<0.05),the activity level of GSK-3β in test group 1 was higher than the control group and test group(P<0.05).The GSK-3β protein content of test group 2 was higher than the control group(P<0.05).The male GSK-3β activity level in the test group 1 was higher than the men′s in the control group(P<0.05).Conclusion The GSK-3β protein content has a high expression in the type 2 diabetes mellitus patients.After drug treatment,the patients,who have controlled the blood glucose effectively,still showes high expression of the GSK-3β protein content,but the activity levels showes a significant decline.In male patients with type 2 diabetes blood sugar in the control group of GSK-3β showes significantly higher activity level.

type 2 diabetes mellitus; peripheral blood mononuclear cells; glycogen synthase kinase 3β

譚婕，女，主治醫師,主要從事臨床檢驗診斷學研究。△

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.20.011

A

1673-4130(2016)20-2831-03

2016-04-06

2016-06-11)