鈣調神經磷酸酶基因多態性對環孢素A藥效的影響Δ

姚　婧，海英民，陳丁丁，葛衛紅，朱懷軍#（.南京大學醫學院附屬鼓樓醫院藥學部，南京　0008；.中國藥科大學基礎醫學與臨床藥學院，南京　0008）

鈣調神經磷酸酶基因多態性對環孢素A藥效的影響Δ

姚婧1，2＊，海英民2，陳丁丁2，葛衛紅1，朱懷軍1#（1.南京大學醫學院附屬鼓樓醫院藥學部，南京210008；2.中國藥科大學基礎醫學與臨床藥學院，南京210008）

目的：研究鈣調神經磷酸酶基因多態性對環孢素A（CsA）藥效的影響。方法：收集服用CsA患者的血樣，采用酶放大免疫法檢測CsA谷濃度，以限制性片段長度多態性-聚合酶鏈反應（RFLP-PCR）方法檢測PPP3CA和PPP3CB的基因型，以T細胞核因子（NFAT）下游基因白細胞介素（IL）2、γ干擾素（IFN-γ）和粒-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）的表達作為CsA間接藥效指標，并采用實時定量PCR（RT-qPCR）法檢測其表達，利用相關性分析和多因素回歸等方法研究基因多態性與CsA藥效的關系。結果：共收集CsA血液樣本100份，CsA藥效相關的NFAT下游基因GM-CSF的表達與CsA谷濃度無顯著性相關（rGM-CSF＝－0.04，P＝0.238），IL-2和IFN-γ的表達與CsA谷濃度存在顯著性負相關（rIL-2＝－0.384 3，P＜0.001；rIFN-γ＝－0.335 4，P＜0.001）。以IL-2和IFN-γ mRNA表達均數作為間接藥效指標，發現PPP3CB rs3763679位點基因多態性對CsA藥效有顯著性影響（P＜0.05），而未發現PPP3CA rs3804358對藥效有明顯影響（P＞0.05）。分層分析結果顯示，腎移植和免疫病患者中PPP3CB rs3763679基因變異（TC+TT）的患者藥效優于野生型（CC）（P＜0.05）。將藥效以濃度標化后，多因素回歸分析顯示CsA濃度標化后的藥效與患者性別、PPP3CB rs3763679、乳酸脫氫酶和肌酐呈顯著性負相關，與PPP3CA rs3804358、白細胞計數、尿素氮和三酰甘油等呈顯著性正相關。結論：PPP3CB rs3763679基因多態性對CsA藥效有影響，在腎移植和免疫性疾病患者中，PPP3CB rs3763679TT+TC者藥效優于CC者；同時，性別、PPP3CArs3804358、白細胞計數、乳酸脫氫酶、肌酐、尿素氮和三酰甘油等多種因素皆可不同程度影響標化后CsA藥效，在給予CsA時也需同時考慮多方面的因素。

鈣調神經磷酸酶；環孢素A；個體化給藥；基因多態性

環孢素A（Cyclosporin A，CsA）是一種由11個氨基酸組成的天然親脂性環狀多肽，于1978年首次試用于心臟和肝臟移植，可大大提高移植患者的存活率，是臨床常用的強效免疫抑制劑之一[1]。目前，CsA被廣泛應用于各種器官和組織移植，同時還被用于治療一些自身免疫性疾病、類風濕性疾病和血液系統疾病。

CsA作為鈣調神經蛋白抑制劑的代表藥物，其作用機制在于可選擇性阻滯T細胞介導的免疫反應。CsA進入體內后與親環蛋白A結合，抑制鈣調神經磷酸酶（Calcineurin，CaN）的活性，從而抑制活化的T細胞核因子（Nuclear factor of activated T cells，NFAT）的去磷酸化，使其無法進入細胞核內，從而阻滯白細胞介素（Interleukin，IL）2、γ干擾素（Interferon，IFN-γ）和粒-巨噬細胞集落刺激因子（Granulocyte macrophage-colonystimulating factor，GM-CSF）等促炎癥細胞因子基因的轉錄，最終導致T細胞的活化和增殖被抑制[2-3]。

由于CsA藥動學參數個體差異很大，治療窗窄，不良反應多且嚴重，故臨床常采用CsA谷濃度來監測其藥效，指導藥物劑量的調整，以提高藥物治療的有效性和安全性[4]。但這種方式有其自身的局限性，血藥濃度的改變與藥效改變并非完全相關，存在很大的個體化差異[5-6]。因此，為完善個體化給藥方法，提高用藥安全性和有效性，深入探究CsA藥效的影響因素顯得十分重要和迫切。

從CsA的作用通路可以看出，CaN是CsA作用通路的重要環節。CaN是由催化亞基和調節亞基組成的異性二聚體，其編碼基因為PPP3CA、PPP3CB、PPP3CC、PPP3R1和PPP3R2[7]。He ZH等[8]對CaN編碼基因的55個多態性位點進行了研究，發現其中PPP3CArs3804358和PPP3CB rs3763679兩個位點具有功能性作用，能直接影響CaN的表達。筆者推測，CaN編碼基因的這兩個功能性位點可能與CsA藥效的差異存在相關性。

近年來，相關研究表明IL-2、IFN-γ和GM-CSF等NFAT下游基因的表達與CaN抑制劑的藥效顯著相關，可作為該藥的藥效指標[2，9-10]?；诖耍驹囼炓訬FAT下游基因IL-2、IFN-γ和GM-CSF的表達作為CsA的藥效指標，研究PPP3CA rs3804358和PPP3CB rs3763679的基因多態性與CsA藥效的關系，在分子水平探索CsA反應個體差異的可能機制，以期提高CsA的治療效果，降低藥品不良反應發生的風險，從而優化CsA個體化給藥方案。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器AB2720型聚合酶鏈式反應（PCR）儀、Rotor-Gene 3000型定量PCR儀（澳大利亞Corbett Research公司）；VIVA-E型藥物濃度分析儀（德國Siemems公司）；Sub-Cell型水平電泳槽（美國Bio-Rad公司）；GelX520型凝膠成像分析系統（中國Bioshine公司）。

1.1.2試劑DNA提取試劑盒（美國Promega公司，批號：0000074196）；PCR擴增試劑盒[寶生物工程（大連）有限公司，批號：K9507MA]；引物[寶生物工程（大連）有限公司，批號：AK2405]；內切酶RsaⅠ（北京NEB有限公司，批號：0491212）；內切酶DdeI（北京NEB有限公司，批號：1431306）；逆轉錄試劑PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒[寶生物工程（大連）有限公司，批號：AK2402]；qPCR擴增試劑SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒[寶生物工程（大連）有限公司，批號：K9507MA]；1640培養基（上海立菲生物技術有限公司，批號：8113274）；Trizol（上海立菲生物技術有限公司，批號：28218）；血藥濃度試劑盒（德國Siemems公司，批號：100711）。

1.2方法

1.2.1研究對象收集2013年7月－2014年6月服用CsA并于南京大學醫學院附屬鼓樓醫院（以下簡稱“我院”）監測血藥濃度的患者血樣，診斷不限，性別不限。排除標準：骨髓移植患者、48 h內輸血的患者、CsA同一劑量服用未滿3 d即進行血藥濃度監測的患者、當日送檢血樣超過抽血時間4 h的患者。經患者知情同意后，收集其血樣（外周靜脈血，肝素抗凝）約3～5 ml用于后續研究；同時，收集患者基本資料和臨床檢測數據。

1.2.2血樣處理獲取患者送檢血樣后，4 h內處理。取1 ml血樣提取DNA后用于PPP3CA和PPP3CB基因型檢測；另取1 ml血樣用佛波酯（100 ng/ml）和離子霉素（5 μg/ml）37℃刺激3 h后，使用ACK紅細胞裂解液裂解紅細胞，使用Trizol法提取外周血單個核細胞（Peripheral blood lymphocytes，PBMC）總RNA，檢測純度和濃度后，逆轉錄為互補DNA（cDNA），于－20℃儲存；另取100 μl血樣用于CsA全血谷濃度檢測。用于基因型檢測的血樣凍存于－20℃，RNA提取立即進行，血藥濃度檢測于當日進行。

1.2.3CsA血藥谷濃度檢測采用酶放大免疫（EMIT）法檢測CsA谷濃度，使用VIVA-E型藥物濃度分析儀，按照血藥濃度試劑盒說明書操作。取受試者全血100 μl，加入前處理液300 μl，渦旋40 s，以轉速14 000 r/min、離心半徑13.5 cm離心10 min，取上清液檢測。

1.2.4基因型檢測采用限制性段長度多態性-聚合酶鏈反應（RFLP-PCR）法。取1 ml血樣提取DNA后，進行PCR擴增反應，PPP3CA rs3804358和PPP3CB rs3763679及其引物序列見表1。PCR產物置－20℃保存，并使用電泳分析檢測PCR擴增產物，擴增產物應均有1條清晰條帶且陰性對照無條帶。PPP3CA rs3804358擴增產物為296 bp，PPP3CB rs3763679擴增產物為370 bp。使用DdeⅠ和RsaⅠ限制性內切酶酶切，酶切產物用瓊脂糖凝膠電泳分析，并以此作基因分型。凝膠電泳基同型分析結果見表2。

表1　基因及其引物序列Tab 1　Gene and primer sequence

表2　凝膠電泳基因型分析結果Tab 2　Results of gel electrophoresis genotype analysis

1.2.5CsA藥效相關基因表達的檢測取20μl cDNA，采用實時定量PCR（RT-qPCR）法測定IL-2、IFN-γ和GM-CSF等NFAT下游基因的表達。條件為：95℃預變性30 s，40個循環包含95℃變性5 s和60℃退火30 s，最后進行溶解曲線分析。擴增后根據擴增曲線獲取Cp（Crossing point，指PCR過程中，其反應液熒光信號增至超過其本底熒光所需要的循環數）值。以β-actin為內參。所用引物見表1。

1.3統計學方法

2　結果

2.1患者基本資料

納入本研究的患者100例，其中男性60例，女性40例；年齡（41.24±14.9）歲；診斷包括血液疾病46例，腎移植35例，免疫性疾病15例，其他疾病4例；CsA平均谷濃度為（142.51±72.9）ng/ml，中位數為116.9 ng/ml，四分位間距為42.5～325.4 ng/ml?；颊呋举Y料見表3。

表3　患者基本資料（±s）Tab 3　The basic information of patients（±s）

表3　患者基本資料（±s）Tab 3　The basic information of patients（±s）

44.0±34.9 39.2±19.7 220.3±90.5 16.6±1.1 74.5±2.1 43.8±4.0 5.0±1.1 4.9±3.8 7.5±48.1 1.88±0.63項目n性別（男/女），例年齡，歲CsA谷濃度，ng/ml血常規白細胞計數，×109L－1淋巴細胞計數，×109L－1實驗室檢查指標丙氨酸轉氨酶，U/L天冬氨酸轉氨酶，U/L乳酸脫氫酶，U/L總膽紅素，μmol/L總蛋白，g/L白蛋白，g/L葡萄糖，mmol/L尿素氮，mmol/L肌酐，μmol/L三酰甘油，mmol/L血液疾病46 27/19 35.0±14.6 180.9±80.3腎移植35 27/8 44.5±11.5 99.4±31.6免疫性疾病15 3/12 44.2±14.0 131.89±59.00其他4 3/1 61.5±14.4 116.7±71.2 3.28±2.10 1.26±0.95 7.33±2.29 1.80±0.70 7.36±3.60 1.80±0.90 5.7±1.91 1.73±0.50 35.86±29.40 23.7±14.7 225.2±88.6 15.7±8.1 65.9±7.2 40.3±5.0 5.4±1.0 6.5±3.0 68.0±34.8 2.08±1.35 41.8±71.1 24.2±15.1 198.5±52.8 17.1±7.7 69.1±6.4 44.3±3.8 5.0±0.5 7.2±2.4 99.8±32.8 1.56±0.80 77.7±129.0 37.5±45.5 224.5±113.6 12.9±7.5 64.4±7.0 39.6±5.5 5.2±1.5 6.5±2.6 56.5±35.4 2.15±0.52

2.2CaN基因型

根據酶切產物進行基因分型。兩個基因在本研究方法條件下擴增，所得PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳分析，并與DNA Marker對照后，得PPP3CA和PPP3CB基因的分型結果，詳見表4。

表4　PPP3CA和PPP3CB基因的分型結果Tab 4　Genotyping of PPP3CA and PPP3CB

2.3CsA藥效相關基因表達與血藥濃度的相關性

本研究主要檢測了CsA藥效相關的NFAT下游基因mRNA的表達，包括IL-2、IFN-γ和GM-CSF。每批次qPCR均帶校正樣本，用以校正批次之間的誤差，所有批次結果最終以qBASE 1.0.1處理，得IL-2 mRNA相對表達量為（－6.26± 4.2），IFN-γ的相對表達量為（－2.6±3.3），GM-CSF相對表達量為（－6.81±3.54）。NFAT下游基因mRNA相對表達量與CsA谷濃度的關系散點圖見圖1。

圖1　NFAT下游基因mRNA相對表達量與CsA谷濃度的關系散點圖A.IL-2；B.IFN-γ；C.GM-CSFFig 1 The scatter plot of relative mRNA expression of NFAT-regulated genes with trough concentration of CsAA.IL-2；B.IFN-γ；C.GM-CSF

分別以IL-2、IFN-γ和GM-CSF 3種基因表達為因變量，CsA谷濃度為自變量，進行單因素相關分析。結果發現，IL-2和IFN-γ的表達與CsA谷濃度存在顯著性負相關（rIL-2＝－0.384 3，P＜0.001；rIFN-γ＝－0.335 4，P＜0.001），而GM-CSF表達與CsA谷濃度無線性相關（rGM-CSF＝－0.04，P＝0.238）。可見，CsA谷濃度與藥效的相關性存在個體差異。

2.4CaN基因多態性與CsA藥效的關系

為評估影響CsA藥效的基因型，以IL-2和IFN-γ兩個基因mRNA的相對表達均數作為間接藥效指標，定義CsA藥效E（%）＝（mRNA相對表達均數最大值－mRNA相對表達均數）/ mRNA相對表達均數極差×100%。

使用Skewness/Kurtosis tests檢驗E符合正態分布，故采用t檢驗比較PPP3CA rs3804358和PPP3CB rs3763679兩個位點基因型對藥效的影響，由于PPP3CA rs3804358 CC及PPP3CB rs3763679 TT基因型例數較少，合并至雜合子分析，結果如圖2、圖3所示。

圖2　CaN基因多態性與CsA藥效的關系箱圖A.PPP3CArs3804358基因型；B.PPP3CB rs3763679基因型Fig 2 Boxplots of the relationship between CaN mononucleotide gene polymorphism and the efficacy of CsAA.PPP3CArs3804358genotype；B.PPP3CB rs3763679genotype

從圖2可以看出，PPP3CA rs3804358位點基因多態性對CsA的藥效無影響（P＞0.05），而PPP3CB rs3763679位點的基因多態性對CsA藥效有顯著性的影響（P＜0.05），突變型（TC+ TT）患者服用CsA藥效優于野生型（CC）患者。以患者疾病類型進行分層分析，如圖3所示，PPP3CB rs3763679位點的基因多態性對血液疾病患者無顯著影響（P＞0.05），而在腎移植和免疫性疾病患者中有顯著性影響，突變型（TC+TT型）皆優于野生型（CC型）患者（P＜0.05）。

圖3　PPP3CB rs3763679位點基因多態性對不同疾病CsA藥效的影響A.血液疾??；B.腎移植；C.免疫性疾病Fig 3　The effect of PPP3CB rs3763679 gene polymorphism on CsA efficacy in different diseasesA.hematology；B.renal transplant；C.immunopathy

2.5CsA濃度標化后藥效的相關影響因素的多因素分析

為更好地衡量CsA的藥效，將“2.4”項下計算的藥效以谷濃度進行標化（E/C），分析CsA濃度標化后藥效的影響因素。采用多因素回歸分析，以E/C為因變量，患者的年齡、性別（男：0，女：1）、基因型（野生型：1，突變型：2）、白細胞計數、淋巴細胞計數、轉氨酶、總蛋白、白蛋白、尿素氮、肌酐和三酰甘油等作為自變量，通過逐步法篩選影響藥效指標的因素。結果顯示，上述因素皆可以不同程度影響濃度標化后的CsA藥效，結果見表5。由表5可見，CsA濃度標化后藥效與患者性別、PPP3CB rs3763679突變型（TC+TT）、乳酸脫氫酶和肌酐呈顯著性負相關，與PPP3CA rs3804358突變型（GC+CC）、白細胞計數、尿素氮和三酰甘油呈顯著性正相關。

表5　CsA濃度標化后藥效的影響因素Tab 5　Influential factors of CsA efficacy after normalized by CsA trough concentration

3　討論

本研究以CsA藥效通路中的CaN為研究對象，以NFAT下游基因的表達作為藥效指標，分析CaN編碼基因PPP3CA和PPP3CB的多態性對CsA藥效的影響，從而為CsA臨床應用的效果和安全性提供理論依據和指導作用。

本研究共收集CsA血樣100份，患者診斷包含血液疾病、腎移植和免疫性疾病等。在數據處理中發現，雖然IL-2、IFN-γ與CsA谷濃度存在顯著相關，但個體之間的表達存在差異，可能是不同個體藥效基因的差異所導致，CsA的藥效很容易受機體各種因素的影響[11-12]。從比較的結果看，未發現PPP3CA rs3804358多態性對CsA藥效的影響，筆者考慮這可能是由于該位點突變率較低的緣故。而腎移植和免疫性疾病PPP3CB rs3763679 TT+TC基因型患者CsA藥效高于CC基因型患者，提示此類患者PPP3CB rs3763679基因型為CC時，需考慮更高的CsA劑量。

為探尋CsA藥效的其他影響因素，筆者使用谷濃度將藥效進行標化，從而排除濃度對藥效的影響，并使用多因素回歸模型進行分析。結果發現，除了PPP3CB rs3763679多態性對藥效有顯著影響（P＜0.05），患者的性別也會對CsA的標化后藥效產生影響（P＜0.05）。有研究發現男女激素分泌、藥物代謝等各方面差異皆可對CaN抑制劑的治療結果產生差異[13-14]。Tornatore KM等[15]研究發現。由于CsA清除率和ABCB1基因表達的不同，男性和女性患者使用CsA后會有不同的轉運速率和胞內濃度。動物實驗顯示，雌性動物需要較高的CsA劑量來抑制腎移植后排斥反應的發生[16]。還有可能在CsA藥效通路中，存在著尚未發現的男女性基因上的差異等其他原因，有待于進一步研究。

多因素回歸結果表明，除了CaN基因多態性和性別可影響CsA濃度標化后的藥效外，患者白細胞計數、乳酸脫氫酶、尿素氮、肌酐和三酰甘油等各種因素都會對CsA濃度標化后的藥效產生影響。這提示，CsA的藥效會受到多種因素的影響，在給予患者CsA時也需綜合考慮多方面的指標。

除此之外，個體間仍然存在很多未知的、可影響藥效的個體因素。本研究尚存在樣本量小、未考量患者服藥后臨床表現等不足之處。在后續研究階段，有待擴大樣本量的進一步考察。

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（編輯：李勁）

Influence of Calcineurin Gene Polymorphisms on the Efficacy of Cyclosporine A

YAO Jing1，2，HAI Yingmin2，CHEN Dingding2，GE Weihong1，ZHU Huaijun1（1.Dept.of Pharmacy，the Affiliated Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School，Nanjing 210008，China；2.School of Basic Medicine and Clinical Pharmacy，China Pharmaceutical University，Nanjing 210008，China）

OBJECTIVE：To study the influence of calcineurin gene polymorphism on the efficacy of cyclosporine A（CsA）. METHODS：The blood samples of patients treated with CsA were collected.The trough blood concentration of CsA was detected by EMIT.The genotype of PPP3CA and PPP3CB was assayed by RFLP-PCR method.The expression of NFAT-regulated gene IL-2，IFN-γ and GM-CSF were measured by RT-qPCR，which were used to define the index of indirect efficacy of CsA.The relationship of gene polymorphism with CsA efficacy was study by relationship analysis and multiple factor regression method，etc.RESULTS：A total of 100 blood samples were collected.There was no significant correlation between the expression of CsA efficacy-related NFAT-regulated gene GM-CSF and trough concentration of CsA（rGM-CSF＝－0.04，P＝0.238）；the expression of IL-2 and IFN-γ were negatively correlated with trough concentration of CsA significantly（rIL-2＝－0.384 3，P＜0.001；rIFN-γ＝－0.335 4，P＜0.001）.Using the average value of mRNA expression of IL-2 and IFN-γ as indirect efficacy index，the polymorphism of PPP3CB rs3763679 site significantly influenced the efficacy of CsA（P＜0.05），but PPP3CA rs3804358 had no any effect on it（P＞0.05）.Stratified analysis showed that among patients with immune disease underwent renal transplantation，efficacy of patients with PPP3CB rs3763679 genovariation（TC+ TT）were better than those with wild-type gene（CC）（P＜0.05）.After the efficacy was normalized by CsA trough concentration，multivariate analysis showed that normalized efficacy of CsA was negatively correlated with gender，PPP3CB rs3763679，lactate dehydrogenase and creatinine significantly，but positively correlated with PPP3CA rs3804358，leucocyte count，usea nitrogen，glycerin trilaurate，etc.CONCLUSIONS：PPP3CB rs3763679 gene polymorphism influence the efficacy of CsA；among patients with immune disease underwent renal transplantation，efficacy of patients with PPP3CB rs3763679 TT+TC is better than that of CC type.At the same time，gender，PPP3CA rs3804358，leucocyte count，usea nitrogen，glycerin trilaurate and other factors all can influence the normalized efficacy of CsA to different extent.Multiple factors should be considered when using CsA.

Calcineurin；CyclosporinA；Individual administration；Gene polymorphism

R969.1；R979.5

A

1001-0408（2016）29-4033-05

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.29.01

南京市科技發展指導性計劃藥學項目（No.2013 YX001）；江蘇省“六大人才高峰”資助項目（No.2011-WS-009）

＊碩士研究生。研究方向：臨床藥學。電話：025-83105670。E-mail：yyaojing@yeah.net

主管藥師。研究方向：臨床藥學。電話：025-83105670。E-mail：sesisi@163.com。

（2015-11-13

2015-12-05）