VX2移植性兔直腸癌淋巴結轉移動物模型的建立及其生物學特性

孫軼群，童 彤，毛 健，鐘芳芳，顧雅佳

VX2移植性兔直腸癌淋巴結轉移動物模型的建立及其生物學特性

孫軼群1，童 彤1，毛 健1，鐘芳芳2，顧雅佳1

1.復旦大學附屬腫瘤醫院放射診斷科，復旦大學上海醫學院腫瘤學系，上海 200032；

2.復旦大學附屬腫瘤醫院病理科，復旦大學上海醫學院腫瘤學系，上海 200032

背景與目的：直腸癌淋巴結轉移模型是研究腫瘤發生、發展、轉移及抗腫瘤治療的工具，但較大型動物模型鮮見報道。該研究旨在建立可行性強、重復率高的VX2移植性兔直腸癌淋巴結轉移模型。方法：采用原位移植方法，將切好的小瘤塊置入穿刺針內，并使用穿刺針將小瘤塊推入到新西蘭大白兔的直腸壁內。共制作模型20只。每周使用MR掃描2只實驗兔，MR上觀察腫瘤生長情況及腸周淋巴結個數，使用MR后處理軟件測量實驗兔的直腸壁腫瘤體積，掃描完成后進行詳細解剖，切除直腸壁上腫瘤及腸周淋巴結，進行標本固定及HE染色，并探討腫瘤體積與生長時間及轉移淋巴結個數的關系。結果：成功制作模型13只，成功率為65%。于第4周開始在MR上可觀察到局限于直腸壁腫塊。隨著時間增長，腫瘤體積不斷增大，且不同時期（生長周數）腫瘤體積差異有統計學意義（F=52.865，P＜0.05）；進一步分析得出，腫瘤的平均體積與生長周數呈正線性相關（r=0.910），差異有統計學意義（P＜0.05）。當腫瘤體積大于9 cm3時，實驗兔開始出現轉移性淋巴結，第9周開始轉移淋巴結個數明顯增多。統計分析得出腫瘤體積越大，轉移性淋巴結個數就越多（F=92.531，P＜0.05），且兩者呈線性相關（r=0.945），差異有統計學意義 （P＜0.05）。結論：本實驗將組織學完整的VX2移植瘤組織塊原位種植到新西蘭大白兔直腸內，成功建立了VX2移植性兔直腸癌的淋巴結轉移模型。本模型對于研究直腸癌的局部生長、浸潤機制、淋巴結轉移灶及生物學特性均有一定價值。

模型；直腸癌；轉移性淋巴結

我國直腸癌發病率以每年2%的速度上升，在消化系統腫瘤中位于第3位。直腸癌術前分期對于患者治療方法的選擇有很大的關系，即使接受根治性手術的患者中仍有40%～50%死于術后腫瘤復發與轉移［1］，其中淋巴結轉移是常見的轉移方式，且淋巴結轉移又可以進一步成為血行轉移的橋頭堡［2］。由于缺乏原位直腸癌淋巴結轉移模型，故對影像學轉移淋巴結的檢出及研究難以深入進行。迄今為止，關于直腸癌動物模型以裸鼠皮下移植瘤及原位種植瘤較多見［3-4］，但相關研究多采用較小的實驗動物模型，而且成模后的進一步影像評估和治療干預也存在困難。目前鮮見國內有關于較大型原位直腸癌淋巴結轉移模型制作的報道，所以本實驗旨在為直腸癌淋巴結轉移的檢出、治療的研究提供可行性強、重復率高的較大型實驗動物模型。

1　材料和方法

1.1 材料

1.1.1VX2荷瘤種兔

由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，體質量3～4 kg，后腿肌肉內見局部隆起的軟組織腫塊，腫塊質韌，大小約2.5 cm× 2.5 cm×2.5 cm。

1.1.2實驗動物

清潔級健康新西蘭大白兔20只，由復旦大學實驗動物部提供，體質量2.5～3.0 kg，雌雄各半，4～6個月齡。

1.2 方法

1.2.1模型制作前準備及傳代

剝去VX2荷瘤兔后腿肌肉內的瘤塊，取瘤塊邊緣生長旺盛的魚肉樣組織，剔除筋膜和壞死組織，使用眼科剪將選取好的組織剪切成體積約為2 mm×2 mm×2 mm的瘤塊，浸入0.9%NaCl溶液備用，使用20號骨穿針將切好的小瘤塊移植于健康兔后腿外側肌肉內，4周左右進行1次保種傳代。

1.2.2模型制作

實驗兔前1 d禁食，隨機選取。磁共振掃描前5 min對新西蘭大白兔采用氯胺酮與地西泮混合液（2 mL氯胺酮和 2 mL地西泮）進行肌內注射麻醉，用量為 0.20～0.25 mL/kg。待實驗動物麻醉后仰臥位四肢固定，并消毒兔子肛門周圍。將切好的小瘤塊置入穿刺針內待用。助手利用卵圓鉗將實驗兔肛緣提起以張開肛門及直腸下段，然后將載有瘤塊的穿刺針沿直腸壁進針2～3 cm深度，借助無影燈觀察針尖是否穿入腸壁，若針尖停留位置在直腸壁內，借助注射器針頭將小瘤塊推入到直腸壁內，沿腸壁輕輕退出穿刺針，并用生物OB膠（醫用粘連劑，購自廣州白云醫用膠有限公司）封閉進針口，術畢。若針尖穿透直腸，則換位置繼續進針。實驗兔一般1 h內蘇醒，蘇醒后即可恢復其正常飲食。

1.2.3MR監測腫瘤生長狀況

從第1周開始，每周對其中2只實驗兔進行MR掃描，觀察移植腫瘤生長情況。并利用MR后處理系統3D-MIP中的Segment功能測量腫瘤體積大小，使用其中的quick paint工具，在橫斷位T2WI圖上對腫瘤信號區域感興趣區（region of interest，ROI）進行勾畫，將每個層面的腫瘤信號畫入，最后點擊measure volume即可計算出勾畫的腫瘤體積VROI。由于橫斷位T2WI掃描為有間隔的掃描，間隔為1 mm，使用quick paint未能將間隔畫入ROI，間隔區體積的測量使用粗略算法:用上下兩層ROI面積的平均值乘以間隔厚度，即V間隔=1×（An+An+1）/2（n≥1）（V=volume；A=area）。V總=VROI+V間隔。

1.2.4MR檢查

所有實驗兔檢查前不需要腸道準備，未服用腸道解痙藥物。檢查時受檢實驗兔取仰臥位。采用3.0 T（Signa Horizon，GE Medical Systems）MR掃描儀，使用柔軟體線圈發射并接收信號。掃描參數:冠狀位T1WI: TR=620 ms，TE=7 100 ms，Matrix=352×192，層厚=3 mm，層間距=0.5 mm，FOV=200 mm。冠狀位T2WI: TR=2 500 ms，TE=106 ms，Matrix=320×224，層厚=3 mm，層間距=1 mm，FOV=200 mm。矢狀位T2WI:TR=3 220 ms，TE=103 ms，Matrix=320×224，層厚=3 mm，層間距=0.5 mm，FOV=200 mm。橫斷位T2WI: TR=3 900 ms，TE=93 ms，Matrix=256×256，層厚=4 mm，層間距=1 mm，FOV=120 mm。

1.2.5MR判斷轉移淋巴結的標準

判斷轉移性淋巴結的標準:淋巴結短經大于3 mm，或在T2WI圖像上顯示混雜信號并且邊緣不規整的淋巴結視為轉移。

1.2.6觀察直腸周圍淋巴結生長情況

每周掃描2只實驗兔。MR掃描完成后，觀察腸周淋巴結生長情況，并立即處死已完成掃描的2只實驗兔，對直腸及周圍鄰近器官進行詳細的解剖學檢查。肉眼觀察移植瘤生長部位、質地、活動度及移植瘤周圍的淋巴結位置、個數；并將移植瘤及淋巴結完整切除。移植腫瘤及淋巴結使用4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片，經蘇木精-伊紅染色，在光鏡下觀察。

1.3 統計學處理

采用SPSS 13.0統計軟件分析。統計方法采用方差分析與直線回歸分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結　果

2.1 移植瘤生長情況

成功制作VX2移植性兔直腸癌模型13只，成功率65%（13/20，表1，圖1～6）。造模后前3周MR上未見明顯異常腫塊。在第4周，MR上觀察到局限于直腸壁的腫塊，其邊界清楚，T2WI信號均勻，未見明顯壞死灶。解剖見腫瘤在直腸壁內呈圓形，腫瘤結節呈灰白色，魚肉樣，質硬，其內見豐富的供瘤血管。第5周行MR掃描及解剖，腫瘤情況均如第4周所見。第6、7周時MR上腫瘤邊界不清，T2WI信號不均勻，腫瘤內部出現少許壞死灶。解剖后見腸壁內腫塊，內部中央見少許液化壞死區，實性區仍見豐富的供瘤血管。第8～10周，MR上見腫瘤體積增大明顯，并與盆腔壁黏連，T2WI信號更不均勻，腫瘤下端突出肛門向外生長，另有腸膨脹表現。解剖時腫瘤與盆壁不易分離，腫瘤內部壞死范圍愈加明顯。其中1只實驗兔，于第9周時死于衰竭。利用MR后處理軟件測得不同時期腫瘤體積，由表1可見:4～10周內，隨著時間增長，腫瘤體積不斷增大，且不同時期（生長周數）腫瘤體積差異有統計學意義（F=52.865，P＜0.05）。進一步分析得出，腫瘤平均體積與生長周數呈正線性相關（r=0.910），差異有統計學意義（P＜0.05，表2，圖7）。

表 1 實驗兔生長情況Tab. 1 General introduction of the experimental rabbits

圖 1 移植瘤接種后第3周MR圖像Fig. 1 MR images 3 weeks after building model

圖 2 移植瘤接種后第4周MR圖像Fig. 2 MR images 4 weeks after building model

圖 3 移植瘤接種后第7周MR圖像Fig. 3 MR images 7 weeks after building model

圖 4 移植瘤接種后第8周MR圖像Fig. 4 MR images 8 weeks after building model

圖 5 移植瘤接種后第9周MR圖像Fig. 5 MR images 9 weeks after building model

圖 6 移植瘤接種后第10周MR圖Fig.6 MR images 10 weeks after building model

2.2 腸周淋巴結生長情況

MR圖像上觀察腸周淋巴結（表1，圖1～6）。實驗兔前5周（圖1～2）腸周未見明顯腫大淋巴結，解剖后對直腸及盆腔進行詳細檢查，也未見明顯腫大淋巴結。第6周時，MR掃描見1只實驗兔腸周出現1枚類圓形的腫大淋巴結，邊緣較清晰，解剖后摘除此枚淋巴結后病理證實為轉移性淋巴結。第7周MR掃描（圖3），2只實驗兔分別可見1枚明顯腫大淋巴結，術后病理均證實為轉移性淋巴結。第8周MR掃描（圖4），2只實驗兔分別見2枚腫大淋巴結，形態欠規則，T2WI信號不均勻，摘除后病理證實均為轉移性淋巴結。第9周MR掃描2只實驗兔，其中腫瘤體積較小的1只實驗兔腸周見3枚腫大淋巴結（圖5），T2WI信號不均勻，有壞死部分，病理證實3枚均為轉移性淋巴結；另1只腫瘤體積較大的實驗兔腸系膜周見9枚異常強化淋巴結，沿腸系膜呈串珠樣分布，部分相互融合，T2信號不均勻，病理證實為8枚轉移性淋巴結及1枚癌結節。其中1只實驗兔于第9周的第3天衰竭而死亡，第10周MR掃描時僅剩1只實驗兔，MR上見10枚呈串樣分布的異常腫大淋巴結（圖6），T2WI信號亦不均勻，病理證實為8枚轉移性淋巴結及2枚癌結節。第9周開始，實驗兔腸周轉移淋巴結個數開始明顯增多。

2.3 淋巴結個數與腫瘤體積的關系

當腫瘤體積小于等于9 cm3時，5只實驗兔均未出現轉移性淋巴結，腫瘤體積超過9 cm3但不足30 cm3時，3只實驗兔出現1枚轉移性淋巴結，腫瘤體積大于等于30 cm3但不足53 cm3時，3只實驗兔有2或3枚轉移性淋巴結。當腫瘤體積大于等于70 cm3時，轉移性淋巴結個數明顯增多，多達8枚（表1）。經統計，腫瘤體積越大，轉移性淋巴結個數越多（F=92.531，P＜0.05），且兩者呈線性相關（r=0.945，P＜0.05，表3，圖8）。

2.4 直腸癌模型組織學特征

腫瘤組織活檢并行HE染色（圖9）。低倍鏡下可見浸潤性癌巢，無明顯邊界，間質分界不清，結締組織較少，癌巢邊緣分布著被浸潤的腸壁結構。腫瘤細胞彌散排列，可見纖維間隔，新生毛細血管豐富。高倍鏡下見瘤細胞體積大，形態不規則，呈不規則排列；細胞質豐富，淡紅染色；核肥大，其大小及形態各異，染色深淺不均，核分裂象多見。

2.5 轉移性淋巴結組織學特征

腸周淋巴結組織活檢并行HE染色（圖10）。低倍鏡下見正常淋巴結結構被破壞，出現轉移性腫瘤組織，高倍鏡下見腫瘤組織成巢狀結構排列。腫瘤細胞體積增大，邊界欠清，核漿比增大，細胞質豐富粉染，細胞核增大深染，可見病理性核分裂象。

表 2 腫瘤體積與生長周數關系Tab. 2 The relationship between tumor volume and growing number of weeks

表 3 淋巴結個數與腫瘤體積關系Tab. 3 The relationship between the tumor volume and lymph node number

2.6 癌結節組織學特征

腸周癌結節組織活檢并行HE染色（圖11）。低倍鏡下腫瘤組織邊界不清，腫瘤細胞成實性片狀分布，部分區呈乳頭狀分布。高倍鏡下腫瘤細胞呈圓形或橢圓形，細胞較一致，核仁明顯，染色質粗顆粒狀，分布不均，淡紅染色；核肥大，見病理性核分裂象。

圖 7 生長周數與腫瘤體積關系Fig. 7 The relationship between growing number of weeks and volume of tumor

圖 8 淋巴結個數與腫瘤體積關系Fig. 8 The relationship between number of lymph nodes and volume of tumor

圖 9 移植瘤病理HE染色Fig. 9 Tissue section with HE staining of VX2 tumor

圖 10 轉移性淋巴結病理HE染色Fig. 10 Tissue section with HE staining of metastatic lymphnodes

圖 11 癌結節病理HE染色Fig. 11 Tissue section with HE staining of extranodal tumordeposits

3　討　論

腫瘤已成為人類死亡的主要原因之一［5-6］，其中結直腸癌是常見的惡性腫瘤之一［7］，直腸癌淋巴結轉移模型是研究腫瘤發生、發展、轉移及抗腫瘤治療的工具［8-10］。據文獻報道，主要有以下幾種方式。化學誘發模型，即使用化學致癌物通過灌腸和口服等使實驗動物發生結直腸癌，但致癌物質誘癌過程需時較長［11-12］，腫瘤發生的潛伏期個體變異大，不易同時獲得腫瘤大小較均一的動物模型［13］。轉基因動物腫瘤模型，是利用分子生物學手段，對實驗動物基因進行改造或修飾，從而培育出相應腫瘤的動物模型［14］。但目前對于癌基因及抑癌基因還有待深入研究，所以這種建模方法目前并不實用，只能作為一種研究方向。還有一種就是移植性腫瘤模型，是目前應用最多的動物實驗模型。它是將外源性腫瘤的瘤塊或細胞移植到實驗動物體內生長，從而形成腫瘤，此方法因其成瘤率高而被廣泛使用。按照移植部位不同，又可分為原位移植、皮下移植［15］，這兩種移植方式也最為多見。為了盡可能模擬直腸癌自然生長、局部浸潤及轉移的過程，從而產生與人直腸癌類似的生物學特征，因此此次造模選擇了原位移植的方式。

原位移植根據移植方法的不同又可以分為細胞移植和組織塊移植。細胞移植是將一定濃度的體外培養的細胞懸液注射在動物相應部位，不少學者已使用此方法成功制作出直腸癌模型［16-17］。在前期的預實驗中，筆者也嘗試此種方法，亦成功制作出直腸癌模型，并出現淋巴結轉移，但是，由于使用針筒注射時往往因阻力不均及術者用力不均或手法不嫻熟，出現細胞懸液外漏的情況或注射入實驗兔腸壁的細胞懸液差異較大，在相同的生長時間內，腫瘤體積差異較大。

組織塊移植是以將瘤組織小塊接種的方法將腫瘤原位植入動物體內，通過原位移植的腫瘤組織細胞完整，且細胞間的協同性好，模型的生物學行為較為穩定。文獻最常報道的是裸鼠的原位移植，眾所周知，裸鼠體積小，麻醉及手術對裸鼠造成的創傷大，術后可能發生腸梗阻［18］，進行腫瘤原位移植時需要嫻熟而精準的外科操作，對手術器械的選擇要求也高，手術時間不宜過長，因此對于無外科基礎及初學者來講相對困難。此次筆者嘗試選用了體積較大、易進行操作的新西蘭大白兔。

本實驗選用的移植瘤為VX2腫瘤，VX2腫瘤細胞株起源于shope病毒誘發的兔乳頭狀瘤的鱗癌，經過72次移植傳代后正式建立株，命名為VX2，由于兔缺乏針對該腫瘤的抗體，因此可作為穩定可移植的腫瘤細胞株，具有生長迅速、侵襲力強、血供豐富及早期即可發生轉移的優勢；但此腫瘤為鱗癌，因此與人類直腸腺癌相比更易發生壞死。目前有移植到兔的腎臟、肝臟等部位制成的原位腫瘤動物模型的報道。

本組成模率為65%，VX2腫瘤原位移植術后，我們通過觀察MR掃描后圖像判斷是否成瘤，CT掃描也可用于觀察，但是CT軟組織分辨率不高，腫瘤較小時觀察會有局限性；兔子肛門較小，超聲探頭難以進入，故超聲也不作為觀察工具，目前尚無在接種后短期內判斷是否成瘤的方式，如何盡早判斷成瘤，也是本課題組之后研究的重點。但是通過本實驗小組的觀察，若第4、5周行MR檢查未在實驗兔直腸上觀察到腫瘤，則說明造模失敗。此次造模部分未能成功，分析原因可能為:① 瘤塊自身活性低，移植后不易生長；② 兔直腸壁薄，未能將瘤塊移植入實驗兔腸壁；③ 將瘤塊植入直腸壁后，OB膠封閉不嚴。因此在以后的造模過程中，我們通過以下方式進行改善:① 盡可能選取腫瘤邊緣生長旺盛的部位，取其最質韌部分；② 盡可能多地訓練移植術，增加成功概率；③ 使用OB膠封閉穿刺口0.5 h后，進行第2次涂抹，以防封閉不嚴。

在VX2腫瘤原位移植術后，無實驗兔因手術創傷而死亡。惡性腫瘤的生長速度快慢取決于細胞周期的長短、增殖比例及其他因素等綜合作用，大多數惡性腫瘤的生長速度不是恒定不變的，而是交錯出現迅速生長和相對的穩定的狀態。本次建模過程中VX2移植瘤生長速度較快，在相同的生長周期內，不同實驗兔個體間腫瘤體積雖然存在差異，但總體上看來腫瘤體積隨著時間推移而不斷增大且呈正相關。移植瘤較易觀察，實驗兔一般狀況尚可。第6周后腫瘤中心開始壞死，后期腫瘤浸潤盆腔組織，出現相應的并發癥，部分實驗兔衰竭死亡。

此次建模最終目的是觀察VX2移植性兔直腸癌是否能發生腸周淋巴結轉移，在成功接種移植瘤的前5周內未出現轉移性淋巴結，自第6周開始出現轉移性淋巴結，直至第10周，出現8枚以上轉移性淋巴結。轉移性淋巴結個數也與腫瘤體積呈正相關。第9周之前，MR上診斷為轉移性淋巴結的結節經病理證實均為轉移性淋巴結。病理證實第9、10周亦出現癌結節，但在MR觀察時，此結節在T2WI上表現為不均勻高信號，形態飽滿，邊緣毛糙，誤認為是轉移性淋巴結，出現假陽性，但在MR上兩者較難鑒別。

本實驗將組織學完整的VX2移植瘤組織塊原位種植到新西蘭大白兔直腸內，成功地建立了VX2移植性兔直腸癌的淋巴結轉移模型。在移植后第4～7周，腫瘤生長迅速，以腫瘤本身生長為主，且質地均勻，若僅僅是以研究直腸腫瘤本身而言，此時期為最佳研究時期。在移植后第6周直腸腫瘤周圍開始出現轉移性淋巴結，因此對研究直腸癌淋巴結轉移這一內容而言，移植第6周后為最佳研究時期。直腸癌周圍轉移性淋巴結，自移植后第7周開始T2信號不均勻。綜上所述，此模型對于研究直腸癌的局部生長、浸潤機制、淋巴結轉移灶及生物學特性均有一定價值。學者們可以根據不同的實驗要求（觀察腫瘤本身還是轉移性淋巴結），選擇移植后不同生長時期的實驗兔進行研究。

理想的直腸癌淋巴結轉移模型應具備以下幾個特點:① 盡可能模擬人類直腸癌生長、浸潤及轉移過程；② 造模成功率高，動物模型一般情況好且存活時間較長；③ 模型的建立不僅可行而且具有可重復性的特點。雖然，此次模型模擬了直腸癌淋巴結轉移，但也不能滿足上述標準。各種建立模型的方法都有優缺點，應該根據自己的需要選擇適合的動物模型。

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Lymph node metastatic models of VX2 tumor in New Zealand white rabbits and their biological

characteristics

SUN Yiqun1， TONG Tong1， MAO Jian1， ZHONG Fangfang2， GU Yajia1
（1.Department of Radiology， Fudan University Shanghai Cancer Center； Department of Oncology， Shanghai Medical College，Fudan University， Shanghai 200032， China； 2.Department of Pathology， Fudan University Shanghai Cancer Center， Department of Oncology， Shanghai Medical College， Fudan University， Shanghai 200032， China）
Correspondence to: GU Yajia E-mail: cjr.guyajia@vip.163.com

Background and purpose: The lymph node metastatic model of rectal tumor is a useful tool for the research on tumor occurrence， development， metastasis and antineoplastic therapy. There are few reports about establishment of larger animal model. This study aimed to establish feasible and reproducible lymph node metastatic models of VX2 tumor in rabbits. Methods: The VX2 tumor tissue was put into the puncture needle. The VX2 tumor tissue in the needle was orthotopically transplanted into the rectal wall of the New Zealand white rabbits successfully. Twenty New Zealand white rabbits were transplanted. Two experimental rabbits were scanned by MR weekly. Tumor growth curve and lymph node numbers were observed on MR. Experimental rabbit tumor volumes were measured by MR post-processing software. The rectal tumor and surrounding lymph nodes were resected， and the specimens were fixed. The sections were stained with HE. We explored the relationship between tumor volume and growth time，the number of metastatic lymph nodes and tumor volume， respectively. Results: Thirteen models were successfully established with a rate of 65%. Tumors limited in the rectal wall were observed on the fourth week. Tumor sizeincreased over time. There was significant difference in the tumor volume between different periods （growth cycle number） （F=52.865， P＜0.05）. There was a significantly positive correlation between tumor volume and the growth cycle number （r=0.910， P＜0.05）. The metastatic lymph nodes could be observed when VT＞9 cm3. The number of metastatic lymph node increased obviously from the ninth week. The more tumor volume， the greater the number of metastatic lymph nodes was observed （F=92.531， P＜0.05）. There was a significantly positive correlation between the number of metastatic lymph nodes and the tumor volume （r=0.945， P＜0.05）. Conclusion: Metastatic lymph node models of VX2 tumor in New Zealand white rabbits were established successfully. This model has some value in the research on local growth， invasion mechanism， lymph node metastasis and biological characteristics of rectal cancer.

Model； Rectal cancer； Metastatic lymph node

10.19401/j.cnki.1007-3639.2016.10.006

R735.3

A

1007-3639（2016）10-0840-08

顧雅佳 E-mail: cjr.guyajia@vip.163.com

（2015-07-14

2015-11-19）