H PLC測定三種兒童用醫院制劑中防腐劑羥苯乙酯的含量

蘇靜華顧炳仁邢以文徐憶菁

（1蘇州市食品藥品檢驗所，江蘇 蘇州215000；2蘇州大學藥學院 ）

H PLC測定三種兒童用醫院制劑中防腐劑羥苯乙酯的含量

蘇靜華1顧炳仁1邢以文1徐憶菁2

（1蘇州市食品藥品檢驗所，江蘇 蘇州215000；2蘇州大學藥學院 ）

目的：建立測定三種兒童用醫院制劑中防腐劑羥苯乙酯含量的高效液相色譜方法，為兒童用醫院制劑防腐劑限量控制提供依據。方法：色譜柱：Phenomenex Luna C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，）；流動相：甲醇-水（60∶40，V/V）；等度洗脫；柱溫：35℃；檢測波長：256 nm；流速：0.8 mL/min。結果：羥苯乙酯濃度在2.292～ 114.6 μg/mL范圍內線性關系良好（r=1.000 0）。RSD為0.33%，LOD為0.120 μg/mL，紅臀軟膏、硫磺霜和復方潔霉素滴鼻液的平均回收率分別為97.41%，98.44%和96.65%（n=6）。結論：該檢測方法快捷、簡便、準確、可靠，可用于醫院制劑中防腐劑羥苯乙酯的檢測。

羥苯乙酯；高效液相色譜法；防腐劑；兒童；醫院制劑；含量測定

羥苯乙酯是一種高效的防腐劑，為無色結晶或白色粉末，略有麻舌的澀味，易溶于甲醇、乙醇和乙醚，略溶于三氯甲烷，微溶于甘油，幾乎不溶于水，無揮發性，無吸濕性；化學性質穩定，在酸性、中性、堿性溶液中均有抑菌作用，對大腸桿菌作用最強［1］。

紅臀軟膏是以紫草、白芷這兩種中藥為主要成分，用于治療嬰幼兒臀紅的油性基質軟膏劑。臀紅是臨床小兒常見的皮膚疾病，主要癥狀是皮膚潮紅、潰爛甚至脫皮等。5%硫磺霜主要用來治療兒童疥蟲及霉菌感染，其主要成分升華硫，對嬰兒濕疹亦有療效［2］。復方潔霉素滴鼻液是臨床用于治療兒童呼吸道感染的常用藥物之一。其處方中的林可霉素是一種抗生素，能抑制細菌的蛋白質的合成，對G+菌及某些厭氧菌有較強殺滅作用［3］；另一種有效成分地塞米松磷酸鈉是糖皮質激素類藥物，具有抗局部變態反應、抗炎、抗水腫等多種藥理作用［4］，對治療慢性鼻竇炎和哮喘有一定的效果［5］。

因上述三種醫院制劑均為多劑量包裝，開封后接觸空氣，易致微生物滋生，故其處方中均添加了一定量的羥苯乙酯，起到抑菌、防腐的作用。羥苯乙酯是一種在食品、藥品、化妝品中均廣泛使用的防腐劑［6］。盡管現今并未否認羥苯酯類防腐劑使用的安全性，但由于嬰幼兒特別是新生兒皮膚角質層薄，且缺乏溶菌素，因此對各種過敏原極其敏感，皮膚、黏膜長期暴露于防腐劑可能引起不同程度的不良反應［7-10］，所以必須控制其用量。另外，羥苯乙酯的抑菌濃度須控制在0.2～0.8 mg/mL之間［11］，因此若在制劑時投料不足，羥苯乙酯濃度很有可能低于下限，從而達不到理想的抑菌效果，因此需要制定防腐劑的含量限度標準。

《中國藥典》2015年版僅對部分品種的防腐劑含量限度作出了規定，如左氧氟沙星滴眼液要求控制苯扎溴銨的含量為標示量的80%～120%［12］；妥布霉素滴眼液要求檢查羥苯乙酯、羥苯丙酯和苯扎氯銨的含量，為標示量的80%～120%；鹽酸林可霉素滴眼液要求苯甲酸鈉、苯扎溴銨和羥苯乙酯含量偏離標示量均不得大于±20%。但本文所述的三種兒科用醫院制劑在其質量標準中，僅對防腐劑的抑菌效力有檢測要求，對于羥苯乙酯在制劑中的具體含量未作測定要求和限度規定。因此，本文建立了一種能快速準確測定醫院制劑中羥苯乙酯含量的高效液相色譜方法，為兒童用醫院制劑標準提高提供了參考依據。

1 儀器與設備

Waters Alliance e2695高效液相色譜儀（2998型二極管陣列檢測器，EmpowerⅡ色譜工作站）；Merck Millipore Direct-Q3超純水儀；梅特勒-托利多分析天平XS105DC；SHIMADZU UV-2550型紫外分光光度計；科導SK6210HP超聲波清洗器。

2 樣品與試劑

羥苯乙酯對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100847-201102，含量：99.9%）；復方潔霉素滴鼻液（蘇州大學附屬兒童醫院，批號：15061401，15061402，15061403）；紅臀軟膏（蘇州大學附屬兒童醫院，批號：150804，150818，150903）；硫磺霜（蘇州大學附屬兒童醫院，批號：150614，15061402，15061403）。甲醇為色譜純，試驗用水為超純水。

3 方法

3.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Luna C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（60∶40，V/V）；等度洗脫；流速：0.8 mL/min；柱溫：35℃；檢測波長：254 nm。

3.2 樣品處理和溶液制備

3.2.1 對照品溶液的制備 取羥苯乙酯對照品約10.0 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液；精密吸取1 mL對照品貯備液至10 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度約20 μg/mL的對照品溶液。

3.2.2 供試品溶液的制備

3.2.2.1 復方潔霉素滴鼻液供試品溶液的制備 精密量取復方潔霉素滴鼻液1.0 mL，置10 mL容量瓶中，加水稀釋至10 mL，搖勻，作為供試品溶液。

3.2.2.2 紅臀軟膏供試品溶液的制備 取紅臀軟膏約 1.0 g，精密稱定，置 50 mL容量瓶中，加甲醇30 mL，超聲10 min，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，作為供試品溶液。

3.2.2.3 硫磺霜供試品溶液的制備 取硫磺霜約0.5 g，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加甲醇30 mL，超聲10 min，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，作為供試品溶液。

4 結果

4.1 線性關系

精密吸取上述對照品和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖（圖1）。

圖1 羥苯乙酯對照品和三種兒科用醫院制劑的HPLC圖

取羥苯乙酯對照品約 10 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，作為標準母液。精密移取標準母液各1.0，1.0，1.0，1.0，2.0，1.0，1.0 mL，分別置于 10，25，50，100，250，250和500 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，作為系列標準溶液。精密量取上述系列標準溶液各10 μL，在“3.1”項的色譜條件下分別進樣。以濃度C（μg/mL）為橫坐標，峰面積A為縱坐標，繪制標準曲線并進行計算，得羥苯乙酯的線性方程：

Y=56 115.29X-52 628.54（r=0.999 9）。

結果表明，羥苯乙酯的質量濃度在 2.292～114.6 μg/mL范圍內呈良好的線性關系。

4.2 精密度

精密量取“3.2.1”項下質量濃度為22.92 μg/mL的對照品溶液10 μL，在“3.1”項的色譜條件下重復進樣6次，峰面積RSD為0.33%（n=6），表明儀器精密度良好。

4.3 穩定性

將“3.2.1”項下質量濃度為22.92 μg/mL的對照品溶液在常溫下分別保存0，2，4，8，16，24 h后，在“3.1”項的色譜條件下分別進樣10 μL，記錄色譜圖。羥苯乙酯峰面積的RSD為0.65%（n=6）。表明羥苯乙酯對照品溶液在室溫環境下24 h內穩定。

4.4 重復性

精密稱取同一批次的紅臀軟膏（批號：150804）和硫磺霜（批號：150614），精密量取同一批次復方潔霉素滴鼻液（批號：15061402），分別依照“3.2.2”項下的制備方法，各制備6份供試品溶液；按“3.1”項下的色譜條件，分別記錄每份供試品溶液羥苯乙酯的峰面積。RSD分別為1.27%，1.20%和1.86%。

4.5 檢測限

將“3.2.1”項下的對照品溶液不斷稀釋后再進樣，依據色譜圖峰面積，以信噪比 S/N=3計算，得羥苯乙酯的最低檢測限為0.120 μg/mL。

4.6 定量限

將“3.2.1”項的對照品溶液不斷稀釋后進樣，依據色譜圖峰面積，以信噪比S/N=10計算，得羥苯乙酯的定量限為0.400 μg/mL。

4.7 加樣回收試驗

取已知含量的紅臀軟膏（取重復性試驗項下的樣品，批號：150804）6份，每份約 0.5 g，精密稱定，分別置于50 mL容量瓶中；再取已知含量的硫磺霜（取重復性試驗下的樣品，批號：150614）6份，每份約 0.25 g，精密稱定，分別置于 25 mL容量瓶中；另精密吸取已知含量的復方潔霉素滴鼻液（取重復性試驗下的樣品，批號：15061402）6份，每份1 mL，分別置于6個10 mL容量瓶中。在上述容量瓶中各精密加入羥苯乙酯對照品適量，按“3.2.2”項下的方法制備溶液，在“3.1”項下的色譜條件下分別進樣10 μL，記錄色譜圖。結果表明，紅臀軟膏、硫磺霜和復方潔霉素滴鼻液的平均回收率分別為97.41%，98.44%和96.65%（n=6），其RSD分別為1.77%，1.33%和4.31%。見表1。

表1 加樣回收率試驗結果

4.8 樣品測定

精密稱取或量取各批樣品適量，照“3.2.2”項下方法制備供試品溶液后進樣測定（表2），HPLC圖見圖1。結果表明紅臀軟膏和復方潔霉素滴鼻液中羥苯乙酯的含量均比標示量低，而硫磺霜中的羥苯乙酯略高。

5 討論

5.1 測定波長的考察

取“3.2.1”項下的對照品溶液，在210～350 nm波長范圍內進行紫外光譜掃描，結果顯示羥苯乙酯在256 nm處有最大吸收峰且無溶劑峰干擾，故將測定波長定為256 nm。

5.2 提取方法的考察

為了確定制備供試品溶液的超聲時間，本研究做了如下試驗。精密稱取3份重復性試驗項下的紅臀軟膏（批號：150804）各約1.0 g至50 mL容量瓶中，用適量甲醇溶解，分別超聲10，20，30 min后，用甲醇稀釋至刻度，用微孔濾膜過濾后分別進樣，測定羥苯乙酯的含量。三者峰面積的RSD為3.7%，延長超聲時間對羥苯乙酯含量帶來的影響可以忽略不計，因此將樣品超聲時間確定為10 min，以提高提取效率。

表2 三種兒科用醫院制劑中羥苯乙酯的測定結果

5.3 陰性樣品的考察

由于缺乏制備陰性樣品的條件，本文未進行其他輔料的干擾試驗，因此對羥苯乙酯含量測定結果的可靠性帶來一定影響。

5.4 實測樣品數據分析

由表2可以觀察到，批號為150903的紅臀軟膏和其他兩個批次的樣品相比，羥苯乙酯含量顯著偏低，且重復進樣后仍有較大偏離，表明該種醫院制劑可能在批次間的質量同一性方面控制得較差，但要獲得更確切的結論，還需增加測定批次數目。各批次硫磺霜實測結果較為理想，含量均占標示量的80%～120%，且RSD＜3.02%。3個批次的復方潔霉素滴鼻液批次間差異不大，RSD＜2.50%。但含量均偏低，《中國醫院制劑標準》規定的羥苯乙酯抑菌濃度是200～ 800 μg/mL，測得羥苯乙酯的平均含量為（263.3±6.3）μg/mL，僅略高于規定濃度下限，占標示量的平均百分數為65.83%，表明防腐劑可能在處方制備過程中有較大損失，從而達不到要求的抑菌效果，處方制備時需要增加抑菌劑投料。但由于該制劑是鼻黏膜用藥，較易進入血液循環進而在體細胞中累積，因此還要留意投料上限。

［1］ 崔福德.藥劑學［M］.5版.北京：人民衛生出版社，2004：19.

［2］ 韓錫珠.5%硫磺霜加倍氯米松軟膏治療嬰兒濕疹33例臨床分析［J］.中國基層醫藥，2004，11（5）：520.

［3］ 戴自英.實用抗菌藥物學 ［M］.上海：上海科學技術出版社，1999：219-220，225.

［4］ 孫忠實.臨床藥理學［M］.北京：北京科技出版社，2005：333.

［5］ 孔煒.兒童慢性鼻竇炎治療對哮喘控制的臨床觀察［J］.南通大學學報（醫學版），2006，26（2）：133-134.

［6］ 中華人民共和國衛生部藥政局，中國醫藥制劑規范.西藥制劑Ⅱ［M］.北京：中國醫藥科技出版社，1995：123-147，162-167.

［7］ 李中東，張云軒，郭燕萍，等.羥苯酯類防腐劑的不良反應［J］.中國藥物警戒，2012，9（5）：303-305.

［8］ 岳強.對羥基苯甲酸酯在人體中的暴露研究進展 ［J］.北方環境，2011，23（3）：162-163.

［9］ 林忠洋，馬萬里，齊跡，等.對羥基苯甲酸酯類防腐劑的人體暴露［J］.化學進展，2015，27（5）：615.

［10］ 李雅娟，趙曉俊，顧蔚.對羥基苯甲酸酯暴露與乳腺癌患病風險研究進展［J］.2014，43（6）：1038-1042.

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［12］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（2015年版）二部［M］.北京：中國醫藥科技出版社，2015：156.

Content Determination of Ethylparaben as a Preservative in Three Hospital Preparations for Children by HPLC

Su Jinghua1，Gu Bingren1，Xing Yiwen1，Xu Yijing2（1 Suzhou Institute for Food and Drug Control，Jiangsu Suzhou 215000，China；2 College of Pharmaceutical，Soochow University）

Objective：To develop a HPLC method for determination of content of ethylparaben as a preservative in three hospital preparations for children，and provide a basis for quantitative limit of preservative in the preparations. Methods：The determination was carried out on a Phenomenex Luna C18column（250 mm×4.6 mm，5 μm）serving methanol-ultrapure water（60∶40）as a mobile phase by isocratic elution.The detection wavelength was set at 256 nm，while the flow rate was 0.8 mL/min and the column temperature was 35℃.Results：The linear range of ethylparaben was 2.292～114.6 μg/mL （r=1.000 0）.The RSD was 0.33%and the LOD was 0.120 μg/mL.The average recovery rates of the three hospital preparations，i.e.diaper rash ointment，sulfur cream and compound jiemycin were 97.41%，98.44% and 96.65%，respectively.Conclusion：This method is rapid，simple，accurate and reliable for determination of preservative in hospital preparations.

Ethylparaben；HPLC；Preservative；Children；Hospital Preparation；Content Determination

10.3969/j.issn.1672-5433.2016.10.004

2016-05-29）

蘇靜華，女，碩士，主管藥師。研究方向：藥品質量控制。通訊作者E-mail：susan0702@163.com