分子生物學(xué)方法鑒定藥用貝母的研究

朱兆宇+焦紅見

貝母我國中藥材之中是一種常見的品類，其藥用歷史非常悠久，在當前任然屬于非常貴重的中藥材。目前，我國以及發(fā)現(xiàn)的貝母屬以及其變種植物有超過五十種之多，分布地域也及其廣泛，隨著中藥材的商品價值不斷提升，有許多諸如土貝母之類的偽劣品也在市場上大量出現(xiàn)。藥用貝母從其形態(tài)上去看差別非常細微，但是其化學(xué)成分和藥用價值的差別卻是巨大的，所以如何有效的鑒定藥用貝母一直以來都是一項重要的研究課題。近年來，對于分子生物學(xué)技術(shù)的研究取得了長足的進步，其在中藥材鑒定領(lǐng)域的應(yīng)用也正在變得越來越廣泛，本文采用PC-RFLP技術(shù)對貝母樣品進行了分子鑒定研究。

藥用貝母及其鑒定現(xiàn)狀介紹

貝母是我國中醫(yī)學(xué)之中常用的貴重藥材之一，其本身是指百合科貝母屬多種植物的鱗莖，味苦性寒，具備化痰止咳、清熱散結(jié)以及潤肺等多種藥用功能，在咳嗽痰熱類的多種病癥治療中有廣泛的應(yīng)用。目前我國藥典中收載的藥用貝母為百合科貝母屬9種植物：浙貝母、平貝母、伊犁貝母、新疆貝母、川貝母、湖北貝母、暗紫貝母、梭砂貝母、甘肅貝母的新鮮或干燥鱗莖。由于我國貝母產(chǎn)地眾多，且形態(tài)差異不大，所以在鑒定方面一直存在一定的問題，對藥用貝母的臨床應(yīng)用安全性有很大影響。在我國對于中藥材的鑒定長期采用性狀鑒定、顯微鑒定、理化鑒定等幾種方法，但是這些傳統(tǒng)的鑒定的方法在當前已經(jīng)不能滿足中藥發(fā)展的要求，分子生物學(xué)的發(fā)展為藥用貝母的鑒定帶來全新的局面。分子生物學(xué)鑒定方法的應(yīng)用使得鑒定手段越來越豐富，把中藥鑒定從形態(tài)擴展到了DNA，這就大大提高了藥用貝母鑒定的效率，增強了其臨床應(yīng)用的安全性。

資料和方法

試劑。除限制性內(nèi)切酶HinfI、BcnI和Psp1406I；lmol/L的Tris-HCI（12.1g Tris-Base溶于800ml水中，加入濃HCI用酸度計調(diào)節(jié)pH至8.0，加水定容至IL）；O.5mol/L的EDAT（186.1g乙二胺四乙酸二鈉溶于700ml水中，用10mol/L Na0H調(diào)節(jié)pH8.0，加水定容至IL，高溫滅菌后備用）；10*TBE（108g Tris-Base溶于800ml水中，加入55g硼酸和40ml o.5mol/L EDAT，pH8.0，加水定容至IL）；凝膠載樣緩沖液（含50%甘油，0.25%澳酚藍，4℃保存）；O.5mg/ml溴乙錠（EB）工作液（加入凝膠的終濃度為o.5ug/ml）。

方法。將各種貝母的5s區(qū)的PCR擴增產(chǎn)物，分別以Bcnl、HinfI和Psp1406I限制性內(nèi)切酶水解（37℃，4小時），隨后65℃變性處理10分鐘以終止反應(yīng)，取出在2%的瓊脂凝膠上電泳，上樣量為每個樣品8uL。Hinfl酶切體系：20uL反應(yīng)體系中含有10xBuffer 2uL，HinfI0.5uL（10u/uL），模板溶液6uL，超純無菌水適量（補足20ul）；BcnI酶切體系：20uL反應(yīng)體系中含有10xBuffer2uL，BcnI0.6uL（10u/uL），模板溶液6uL，超純無菌水適量（補足20ul）；Pspl406I酶切體系：20uL反應(yīng)體系中含有10xBuffer 2uL，Psp1406I1.2ul（10u/uL），模板溶液6uL，超純無菌水適量（補足20ul）。

結(jié)果

根據(jù)各貝母的5s區(qū)測序結(jié)果，找出了暗紫貝母有而其它貝母無的位點（在5端316bp），用PirmeirPmer5.0軟件篩選出BcnI，并用該軟件確定其它貝母的5s區(qū)全序列均無此酶切位點，因此理想的酶切結(jié)果應(yīng)為：暗紫貝母的5S區(qū)PCR產(chǎn)物被切成316bp和370bp兩段，其它貝母仍保留700bp左右的原長度，這主要是因為5SrDNA在細胞中以高度重復(fù)排列的方式存在，雖然由于同步進化的力量，這些重復(fù)單位間已接近純合，但父母本的差異以及環(huán)境因素的影響仍能導(dǎo)致雜交現(xiàn)象的產(chǎn)生（即各拷貝之間存在著少許差異），因此在實際酶切時，仍有少部分PCR產(chǎn)物不能切開，而非酶切不完全的緣故（研究證明將酶量加大，酶切時間延長后電泳結(jié)果均無變化）。此外，根據(jù)湖北貝母在3184bp處的特異位點選擇出Psp1406I，該酶在其它貝母的5s區(qū)均無酶切位點。

同樣根據(jù)各貝母的5s區(qū)測序結(jié)果，找出了梭砂貝母在5端278bp處的特異位點，用Pirmepirmer5.o軟件篩選出HinfI，并用該軟件在各種貝母（包括梭砂貝母）5s區(qū)全序列中尋找有無該酶切位點，結(jié)果表明：梭砂貝母、浙貝母、蒲忻貝母、甘肅貝母、暗紫貝母分別在5端49與275、615、615、624、616bp處均有該酶的酶切位點，理想的酶切結(jié)果應(yīng)為酶切后梭砂貝母為49bp、229bp、407bp三條帶；浙貝母為615bp和58bp兩條帶；蒲沂貝母為615bp和58bp兩條帶；甘肅貝母為624bp和58bp兩條帶：暗紫貝母為616bp和58bp兩條帶。所有被切后50bp左右的小片段在電泳圖上都幾乎看不見，這主要是由于小分子量的DNA片段在電泳的過程中易發(fā)生擴散，梭砂貝母被HinfI酶切后具有特異性的酶切圖譜，且該法在藥材的鑒定上也很穩(wěn)定。

討論

在貝母屬的眾多植物當中，川貝母是我們?nèi)粘Ｉ钪凶顬槌Ｒ姷囊环N中藥材，其對治療咳嗽疾患有非常好的治療效果。近年來，隨著人們對中藥材需求量的日益增加，川貝母由于生長的速度十分的緩慢，并且對生長的條件要求也十分苛刻，所以其野生資源的數(shù)量是遠遠不能夠滿足臨床應(yīng)用需求的，現(xiàn)已被國家列入了保護藥材物種。以川貝母入藥去治療咳喘疾病，在我國有著悠久的歷史，久而久之人們便認為川貝母是質(zhì)量上乘的藥材，再加上近年來市場需求量的增加，現(xiàn)在的川貝母價格十分昂貴，因此，市場上有大量以次充好的偽品出現(xiàn)，其中以浙貝母幼小鱗莖去冒充的最多。而從以上的鑒定研究可以看到，不同品類的貝母之間存在非常大的差異，其藥用價值也必然是完全不一樣的，浙貝母的毒性就遠遠高于川貝母，所以在臨川應(yīng)用的過程中，其治療效果自然是會有天壤之別的。對于藥用貝母的正確鑒定不僅僅只是關(guān)系患者的利益，對于我國中醫(yī)藥學(xué)的整體進步和發(fā)展也有著非常重要的積極作用。