CKB在大腸癌中的表達及意義

李時孟,何成彥,謝 風,高 申*,楊照微,郭宏華,黃麗紅

(吉林大學中日聯醫院 1.檢驗科；2.消化內科；3.老年病科，吉林 長春130033)

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CKB在大腸癌中的表達及意義

李時孟1,何成彥1,謝 風1,高 申1*,楊照微1,郭宏華2,黃麗紅3

(吉林大學中日聯醫院 1.檢驗科；2.消化內科；3.老年病科，吉林 長春130033)

目的 探討腦肌酸激酶(Creatine kinase B-type，CKB)在大腸癌組織中的表達水平及臨床意義。方法 應用二維色譜及質譜聯用技術分析18例大腸癌患者腫瘤標本，篩選出在大腸癌腫瘤組織和癌旁組織差異表達的蛋白CKB，免疫印跡技術加以印證。結果 質譜鑒定顯示CKB在腫瘤組織中較癌旁組織低表達，免疫印跡印證了其準確性。結論 CKB的低表達在調節腫瘤的發生、發展中起到一定作用。

腦肌酸激酶；大腸癌；液質聯用

(ChinJLabDiagn,2016,20:1646)

腦肌酸激酶(Creatine kinase B-type，CKB)是一類在細胞質中調控能量代謝的酶，國內外有學者指出CKB與腫瘤的發生、發展關系密切[1-7]。本文采用液質聯用技術及免疫印跡技術，旨在研究CKB在大腸癌及癌旁組織中的差異表達及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 標本采集 共收集結直腸科手術切除的18例新鮮的組織標本。以上標本經病理學診斷均為DukesB期腺癌。所有患者手術前均未接受輔助放化療。手術中獲得的癌旁正常組織距癌邊緣大于10厘米，且均取自癌組織上端。待標本離體后，立即取材，液氮速凍，-80℃保存。

1.2 相關儀器及試劑 液相色譜分析儀由安捷倫公司提供，LTQXL離子肼質譜儀由賽默飛世爾公司提供。蛋白質定量試劑盒(RCDC Protein Assay Kit)購于Bio-Rad公司。DNA酶和RNA酶均購自 Sigma 公司。DTT及TPCK修飾所用的測序級胰酶購自Promega公司。實驗用水均由 Milli-Q 超純水發生裝置產生，電阻率保持在18 MΩ·cm。

1.3 方法

1.3.1 總蛋白提取和蛋白濃度檢測 將組織樣品從-80℃冰箱中取出，加入液氮研磨粉碎。每100 mg組織中加裂解緩沖液(7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4%(w/v)3 -[(3 -膽酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸，25 mmol/L精胺，2 mmol/L苯甲基磺酰氟 ，65 mmol/L DTT)200 μl，室溫下振蕩1 h，并加入DNA酶和RNA酶用以去除DNA和RNA。10℃，100,000 g，離心1 h，吸取上清備用。用考馬斯亮藍染色，在595 nm條件下應用核酸蛋白分析儀測吸光度，采用標準曲線法得出各組蛋白濃度，于-80℃保存備用。

1.3.2 蛋白水解多肽混合物制備 取出-80℃保存的蛋白質樣品，平衡室溫，取3倍體積的25 mmol/L NH4HCO3對樣品進行稀釋，調整尿素濃度低于2 mol/L。加入1 mol/L DDT混勻使其終濃度控制在20 mmol/L，置于56℃條件下還原1 h，待反應物降至室溫，加1 mol/L碘乙酰胺，調整終濃度至50 mmol/L，常溫條件下避光30 min。按1∶50比例加入測序級胰酶，放入37℃水浴箱中過夜，酶切產物，真空抽干后-80℃保存。

1.3.3 二維色譜和質譜聯用分離及鑒定多肽混合物 取出上述樣品于0.1%甲酸中溶解，每次實驗取50 μg樣品上樣，行二維液質聯用分析，多肽經反相色譜洗脫后，應用LTQ XL質譜儀檢測，質核比檢測在400-2000 amu范圍內。對強度大于10個單位或有10個以上離子信號的譜圖，進一步進行SEQUEST算法并用Bioworks 3.3.1 SP1軟件包進行數據庫檢索，鑒定相關的多肽及蛋白。進行鑒定的蛋白數據庫是從歐洲生物信息學院網站(http://www.ebi.ac.uk/IPI/)中下載的人蛋白質數據庫(3.51版) 。

1.3.4 免疫印跡分析 在樣品中加入等量 2×載樣液，100℃條件下煮沸5 min，常溫10 000 r/min離心5 min。取20 μl上清液加入至10% SDS-PAGE，恒壓 200 V電泳40 min。將凝膠放在0.025% 考馬斯亮藍R-250染液中震蕩染色1 h，后在7%乙酸，50% 甲醇的水溶液中脫色1 h，再置于20% 甲醇，5% 甘油中過夜，用醋酸玻璃紙干燥備用。將凝膠切膠后平放于纖維素膜上進行轉膜，電流設定為100 mA轉移1 h。轉移結束后，沖洗轉移膜再放入2%BSA封閉液中1h，沖洗兩次，將轉移膜與5 μl /ml 濃度的一級抗體加入雜交袋振搖1 h。洗膜后加入二級抗體反應1小時。再次洗膜后，加底物反應5 min即可。

2 結果

2.1 腫瘤組織和癌旁組織中總蛋白酶解混合物的二維色譜及質譜聯用分析結果 在腫瘤組織酶解混合物的多肽質譜數據中，共鑒定了29 825個多肽序列，得出860個蛋白質鑒定數據。在癌旁組織的多肽質譜數據中，共鑒定了40 388個多肽序列，得出549個蛋白質鑒定數據。

2.2 腫瘤組織和癌旁組織中差異蛋白質譜分析 在差異蛋白鑒定中，譜圖數據需同時滿足兩樣品比值≥1及兩樣品差值≥72，為避免假陽性的發生，每種樣品均行三次實驗而后將三組結果比較分析。共得到44個差異蛋白，其中21個上調蛋白，23個下調表達。CKB質譜圖見圖1。

圖1 CKB質譜圖

2.3 CKB免疫印跡結果

免疫印跡試驗證實CKB在癌組織中表達下調，而在癌旁組織中高表達，見圖2。

圖2 CKB免疫印跡圖

3 討論

大腸癌發病隱匿，初期無典型臨床表現，大多數患者發現時已進入中晚期，即便手術治療并輔以放化療，大腸癌的5年生存率僅為50%[7]。因此，早期診斷仍為大腸癌的研究重點。隨著檢驗技術的不斷發展，蛋白質組學可用于分析蛋白質的組成、表達水平及修飾狀態，通過比較腫瘤組織與癌旁組織的差異蛋白表達，可發現高靈敏度、高特異性的腫瘤標志物[8]。

在脊椎動物的細胞中，肌酸激酶( creatine kinase，CK)是一類很重要的激酶，它可以精確地調節體內能量平衡，維持細胞內ATP水平穩定[9]。CKB是肌酸激酶的一個亞型，廣泛存在于骨骼肌、心肌、神經組織及線粒體中，參與能量信號傳導過程，可逆性地催化磷酸肌酸的高能磷酸鍵與ADP結合而生成ATP和肌酸[10]。很多學者針對CKB在腫瘤發生及腫瘤進展中所參與的能量代謝途徑進行研究，Loo[11]等的研究表明CKB的高表達是大腸癌肝內轉移的機制之一，他指出在肝細胞內的乏氧微壞境中，CKB在 miR-483 及miR-551a的調控下催化磷酸肌酸轉變為ATP，為擴散至肝臟的腫瘤細胞供能。Ruginis[12]等在研究中發現胃泌素釋放肽(Gastrin-releasing peptide，GRP)及其受體(GRPR)在大腸癌中異常高表達，而在表達GRP/GRPR的細胞系中CKB顯著低表達，考慮CKB可縮短腫瘤細胞的生存期。此外，在肺鱗癌、腎癌及膠質瘤中均有研究顯示CKB為下調表達[10，13，14]。而Zeng[15]等在對肺鱗癌的研究中得到了不同的結果，CKB在腫瘤組織中顯著上調并可作為早期診斷的新型腫瘤標志物。Chen[16]等和Li[9]等的研究也分別指出CKB在前列腺癌及卵巢癌中均為上調蛋白。

在本研究中，CKB在大腸癌組織中顯著下調表達，隨后進行的免疫印跡試驗也證實了CKB在癌組織中下調表達，而在癌旁組織中高表達。在以往的研究中，CKB已在多種惡性腫瘤中發現異常表達。雖然表達結果并不一致，但足以說明CKB在腫瘤的發生、發展過程中起到一定的作用，但其具體機制還需進一步研究。

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Creatine kinase B-type Expression in Colorectal Carcinoma and its Clinical Significance

LIShi-meng,HECheng-yan,XIEFeng,etal.

(DepartmentofClinicalLaboratory,China-JapanUnionHospitalofJilinUniversity,Changchun130033,China)

Objective To detect the expression of creatine kinase B-type(CKB) in colorectal carcinoma and its clinical significance.Methods Samples of 18 patients with colorectal carcinoma were analyzed using two-dimensional chromatography and mass spectrometry technology to find differentially-expressed protein peaks including CKB,then CKB was tested by Western blotting.Results Identifications by mass spectrometer showed that CKB in adjacent tissues was significantly higher than that in colorectal carcinoma tissues,we also use Western blotting to conform the results.Conclusion The low expression of CKB is closely related with oncogenesis and progression of colorectal carcinoma.

Creatine kinase B-type(CKB);colorectal carcinoma;LC-MS

國家自然科學基金(81572082)；吉林省科技廳基金(20140311092YY，20150101153,20150414015)

1007-4287(2016)10-1646-03

R735.3+4

A

2015-07-23)

*通訊作者