蒙藥組方對(duì)大鼠乳腺上皮細(xì)胞增殖和分泌及細(xì)胞免疫功能的調(diào)節(jié)

高俊嬌，郝羽翀，王英軍，史紅艷*

(1.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 長春130021；2.長春市圣心心腦血管病醫(yī)院；3.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院)

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*通訊作者

蒙藥組方對(duì)大鼠乳腺上皮細(xì)胞增殖和分泌及細(xì)胞免疫功能的調(diào)節(jié)

高俊嬌1，2，郝羽翀1，王英軍3，史紅艷1*

(1.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 長春130021；2.長春市圣心心腦血管病醫(yī)院；3.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院)

目的 探討蒙藥組方治療乳腺增生的機(jī)制。方法 應(yīng)用不同濃度蒙藥組方刺激體外培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞，測(cè)定乳腺上皮細(xì)胞增殖及酪蛋白mRNA表達(dá)；建立大鼠乳腺增生模型，檢測(cè)不同濃度蒙藥組方對(duì)大鼠T淋巴細(xì)胞亞群的影響。結(jié)果 蒙藥組方可有效抑制乳腺上皮細(xì)胞的增殖，其中0.105 mg/L組在有效抑制乳腺上皮細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)上，對(duì)酪蛋白mRNA表達(dá)無抑制作用；0.105 g/kg蒙藥組方CD4+/CD8+均值高于正常對(duì)照組和模型對(duì)照組，可以促進(jìn)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能，能扭轉(zhuǎn)造模過程對(duì)機(jī)體免疫功能的抑制作用。結(jié)論 蒙藥組方可有效抑制大鼠乳腺上皮細(xì)胞增殖并能促進(jìn)大鼠細(xì)胞免疫功能。

乳腺增生;蒙藥組方；細(xì)胞免疫

(ChinJLabDiagn,2016,20:1643)

目前，應(yīng)用傳統(tǒng)蒙藥組方及其改良組方治療乳腺增生取得了較好臨床療效。本文力圖在細(xì)胞水平探討傳統(tǒng)蒙藥組方對(duì)于乳腺上皮細(xì)胞泌乳功能的影響；并以大鼠為動(dòng)物模型，探討傳統(tǒng)蒙藥組方對(duì)細(xì)胞免疫功能的影響，探究蒙藥治療乳腺增生的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物及對(duì)照藥物

蒙藥組方主要成分包括郁金、王不留行、穿山甲、山慈菇、青皮、牡蠣、山楂、瓜蔞、浙貝母等，由吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院提供。乳癖消片由沈陽紅藥制藥股份有限公司生產(chǎn),國藥準(zhǔn)字Z20003258。他莫昔芬由寧波市天衡制藥有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H33021583。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及抗體

改良型RPMI-1640培養(yǎng)基及胎牛血清由Hyclone生產(chǎn),Dulbecco＇s Modified Eagle Medium(DMEM)購自GIBCO公司,青霉素與鏈霉素購自華北制藥有限公司,表皮生長因子購自英國Pepro-Tech House公司,胰島素、孕酮、轉(zhuǎn)鐵蛋白、谷氨酞胺購自Sigma公司，氫化考的松由天津市生物化學(xué)制藥廠生產(chǎn),CCK8試劑盒由東洋紡織生產(chǎn)，細(xì)胞總RNA提取試劑盒、Trizol、Reverse Transcriptase、PCR試劑盒、dNTP等購自TAKARA公司，Anti-Rat CD3 FITC、Anti-Rat CD8a PE、Anti-Rat CD4 APC均為eBioscience公司產(chǎn)品，10×氯化銨紅細(xì)胞裂解液參照文獻(xiàn)配制及保存。

1.3 方法

1.3.1 蒙藥組方對(duì)大鼠乳腺上皮細(xì)胞增殖及酪蛋白mRNA表達(dá)的調(diào)節(jié) 用相差消化和相差貼壁方法,培養(yǎng)和純化分娩后3-5 d的大鼠乳腺上皮細(xì)胞[1-3]。將濃度為1×105/ml乳腺上皮細(xì)胞100 μl接種于96孔培養(yǎng)板,48 h后分別加入含不同濃度藥物的培養(yǎng)基200 μl，使各組終濃度分別是：他莫昔芬4.200 mg/L、乳癖消1.000 mg/L、蒙藥組方0.420 mg/L、蒙藥組方0.210 mg/L、蒙藥組方0.105 mg/L，每組設(shè)三個(gè)復(fù)孔；1,3和5 d后用CCK8試劑盒及酶標(biāo)儀測(cè)定OD490，并計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增長指數(shù)。細(xì)胞相對(duì)增長指數(shù)(抑制率)=(試驗(yàn)組OD490-對(duì)照組OD490)/對(duì)照組OD490×100%。

將密度1×105/ml的乳腺上皮細(xì)胞200 μl/孔接種于6孔培養(yǎng)板,48 h后按0.420 mg/L、0.210 mg/L、0.105 mg/L在孔內(nèi)加入含蒙藥組方的培養(yǎng)液，每組設(shè)三個(gè)復(fù)孔，在5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)5 d[4]。根據(jù)試劑盒操作說明提取各孔細(xì)胞總RNA。參照逆轉(zhuǎn)錄酶說明書及分子克隆獲得細(xì)胞總RNA的cDNA。根據(jù)Gene Bank中大鼠β-Casien基因(NC_005113)，用PrimerSelect軟件篩選引物序列。上游引物為：5’-TTAAAATACACAAAGACACAA-3’；下游引物為：5’-TGCATAACTAGCCAAACATTC-3’。擴(kuò)增條件如下：94℃ 5 min；94℃ 30 s；55℃ 30 s；72℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min；4℃保存。

1.3.2 蒙藥組方對(duì)大鼠T淋巴細(xì)胞亞群的影響 雌性大鼠70只，隨機(jī)分為7組，每組10只，包括正常對(duì)照組、模型對(duì)照組，他莫西芬4.200 g/kg、乳癖消片1.000 g/kg及蒙藥組方0.420 g/kg、0.210 g/kg、0.105 g/kg組。除正常對(duì)照組外，其余組別每天肌肉注射苯甲酸雌二醇(0.5 mg/kg)，連續(xù)25天后用黃體酮(4 mg/kg)連續(xù)注射5d造成乳腺增生模型[1，4]。造模3w后每天灌胃給藥1次，連續(xù)4w，正常對(duì)照組及模型對(duì)照組給予同等體積蒸餾水。末次給藥1 h后，用10%水合氯醛麻醉，無菌摘取脾，收集脾淋巴細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/ml。用CD3、CD4、CD8抗體標(biāo)記脾淋巴細(xì)胞后在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)[5，6]。

2 結(jié)果

2.1 蒙藥組方對(duì)小鼠乳腺上皮細(xì)胞增殖及酪蛋白mRNA表達(dá)的影響 見表1。將各組別吸光度值輸入SPSS19統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，用單因素AVONA方法分析上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。作用3 d及5 d后，0.420 g/L蒙藥組方組增殖活性值顯著低于正常對(duì)照組；0.210 g/L和0.105 g/kg蒙藥組方5 d組，細(xì)胞增殖活性小于對(duì)照組。應(yīng)用蒙藥組方5 d后大鼠乳腺上皮細(xì)胞酪蛋白β-Casien的RT-PCR結(jié)果見圖1。

表1 各試驗(yàn)組別細(xì)胞吸光度

與對(duì)照組比較*P<0.05,**P<0.001

2.2 實(shí)驗(yàn)藥物及對(duì)照藥物對(duì)大鼠脾T淋巴細(xì)胞亞群的影響

應(yīng)用SPSS19軟件中的單因素AVONA方法分析各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠的脾淋巴細(xì)胞亞群分布結(jié)果見表2。除0.105 g/kg蒙藥組方組外，其他各實(shí)驗(yàn)藥物組、對(duì)照藥物組及模型對(duì)照組的CD4+T淋巴細(xì)胞百分比均低于正常對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。各實(shí)驗(yàn)藥物及對(duì)照藥物組的CD8+T細(xì)胞百分比與正常對(duì)照組及模型對(duì)照組比較均無顯著性差異(表2)。除0.105 g/kg蒙藥組方組外，各實(shí)驗(yàn)藥物組及對(duì)照藥物組脾臟T淋巴細(xì)胞中CD4+/CD8+的值與正常對(duì)照組及模型對(duì)照組比較雖無顯著性差異，但均值都低于正常對(duì)照組；而0.105 g/kg蒙藥組方組中的CD4+/CD8+均值高于正常對(duì)照組及模型對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

M：DNA分子量Marker；Lane 1：0.420 mg/L蒙藥組方組；Lane 2：0.210 mg/L蒙藥組方組；Lane 3：0.105 mg/L蒙藥組方組；Lane 4 正常對(duì)照組。

圖1 應(yīng)用蒙藥組方5 d后大鼠乳腺上皮細(xì)胞酪蛋白β-Casien的RT-PCR結(jié)果

3 討論

不同濃度蒙藥組方在作用5 d后對(duì)大鼠乳腺上皮細(xì)胞均具有抑制作用；0.105 mg/L作用5 d對(duì)大鼠乳腺上皮細(xì)胞的抑制率最低，并且該組酪蛋白表達(dá)量高于0.420 mg/L和0.210 mg/L組。說明在抑制大鼠乳腺上皮細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)上，0.105 mg/L的蒙藥組方對(duì)乳腺上皮細(xì)胞酪蛋白分泌的抑制作用最低。

表2 正常對(duì)照組、模型對(duì)照組與各藥物治療組脾淋巴細(xì)胞亞群的流式細(xì)胞分析結(jié)果±s，n=3)

與正常對(duì)照組比較*P<0.05,#與模型對(duì)照組的比較P<0.05

T淋巴細(xì)胞亞群對(duì)于機(jī)體細(xì)胞免疫及體液免疫具有重要作用。CD4+T細(xì)胞具有調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)活性、輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體、分泌細(xì)胞因子的作用，而CD8+T細(xì)胞具有免疫抑制和細(xì)胞毒性作用。在正常情況下CD4+/CD8+處于相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)。CD4+/CD8+下降甚至倒置是細(xì)胞免疫功能抑制的表現(xiàn)。在本實(shí)驗(yàn)中，模型對(duì)照組大鼠脾臟CD4+T細(xì)胞比例低于正常對(duì)照組，說明模型制備方法對(duì)免疫系統(tǒng)具有抑制作用；而各對(duì)照藥物組和0.420 g/kg蒙藥組方組、0.210 g/kg蒙藥組方組大鼠的脾臟CD4+T細(xì)胞的比例亦低于正常對(duì)照組(P<0.05)，說明各濃度的實(shí)驗(yàn)藥物及對(duì)照藥物不能扭轉(zhuǎn)造模過程對(duì)免疫系統(tǒng)的抑制作用； 0.105 g/kg蒙藥組方組大鼠的脾CD4+T細(xì)胞比例與正常對(duì)照組沒有差異(P>0.05)，說明0.105 g/kg蒙藥組方對(duì)機(jī)體的免疫系統(tǒng)無抑制作用；而且該組的CD4+/CD8+均值高于正常對(duì)照組和模型對(duì)照組，說明0.105 g/kg的蒙藥組方可以促進(jìn)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能，能扭轉(zhuǎn)造模過程對(duì)機(jī)體免疫功能的抑制作用。

[1]顧蓓蓓，苗晉鋒，盧勁曄，等.視黃醇對(duì)LPS誘發(fā)的原代培養(yǎng)大鼠乳腺上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012,43(4)：627.

[2]Debnath J,Muthuswamy Sk,Brugge JS.Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures[J].Methods,2003,30:256.

[3]Allegra M,Zaragkoulias A,Vorgia E,et al.Swmaphorin-7a reverses the ERF-induced inhibition of EMT in Ras-dependent mouse mammary epithelial cells[J].Molecular Biology of the Cell,2012,29:3873.

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[5]王 勇，陳 超.歸參膠囊對(duì)大鼠乳腺增生及脾臟T淋巴細(xì)胞亞群的影響[J].中成藥.2005，27(11)：1297.

[6]王燕燕，祝開榮，陳 超，等.乳潔安膠囊對(duì)大鼠乳腺增生及脾臟T淋巴細(xì)胞亞群的影響[J].中國醫(yī)藥學(xué)雜志，2007,27(1)：44.

The Function of Compound Mongolia Medicine on Rat's Cell-Mediated immunity and Regulation to Proliferation and Secretion of Rat's Mammary Gland Epithelium

GAOJun-jiao,HAOYu-chong,WANGYing-jun,etal.

(TheBasicMedicalSchoolofJilinUniversity,Changchun130021,China)

Objective To study the mechanism of Compound Mongolia Medicine (CMM) on treating mammary gland hyperplasia.Methods Applying different concentration of CMM to stimulate mammary epithelial cells in vitro,the mammary cell proliferation and casein mRNA expression were tested; administrating a series dose of CMM to rat model of mammary gland hyperplasia and detecting the changes of CD4+and CD8+T lymphocyte to evaluate the function of cell-mediated immunity.Results 0.105 mg/L CMM can effectively inhibit the proliferation of breast epithelial cell without inhibiting casein mRNA expression;and 0.105 g/kg CMM can promote the cell-mediated immunity；CD4+/CD8+of 0.105 g/kg CMM group is higher than that of normal control and mammary gland hyperplasia model.Conclusion CMM can effectively inhibit rat mammary epithelial cell proliferation and promote rat cell-mediated immunity.

Hyperplasia of mammary glands;compound Mongolia medicine;cell-mediated immunity

1007-4287(2016)10-1643-03

R655.8

A

2015-10-14)