MACC1對宮頸癌細胞侵襲轉移能力的影響

黃 鶯，吳黎明，張 玲，張 恒，張晶晶，邵建偉，孫慶敏

(1.宜興人民醫院 檢驗科，江蘇 宜興214211；2.南京醫科大學第一附屬醫院 婦科)

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MACC1對宮頸癌細胞侵襲轉移能力的影響

黃 鶯1，吳黎明1，張 玲1，張 恒1，張晶晶1，邵建偉1，孫慶敏2

(1.宜興人民醫院 檢驗科，江蘇 宜興214211；2.南京醫科大學第一附屬醫院 婦科)

目的 探討結腸癌轉移相關基因1(MACC1)對宮頸癌細胞Hela侵襲轉移能力的影響及機制。方法 Western blot法檢測我院10例宮頸癌組織標本和10例癌旁正常組織標本中MACC1的表達，通過脂質體將siRNA-MACC1轉入宮頸癌Hela細胞中，MTT法檢測細胞活力，Transwell法檢測細胞和遷移侵襲能力，Western blot檢測基質金屬蛋白酶(MMPs)及上皮細胞-間充質轉化(EMT)相關蛋白表達量。結果 宮頸癌組織中的MACC1表達量高于癌旁正常組織(P<0.01)，通過脂質體將siRNA-MACC1及陰性對照轉染到宮頸癌Hela細胞后，與對照組比較，siRNA-MACC1組中細胞活力下降，細胞遷移和侵襲能力下降(P<0.01)，MMP2，MMP9及波形蛋白(vimentin)表達量下調(P<0.01)，E-鈣粘蛋白(E-cadherin)表達量上調(P<0.01)。結論 MACC1表達下調能抑制宮頸癌Hela細胞侵襲轉移能力，與逆轉MMPs，EMT相關蛋白表達有關。

MACC1；宮頸癌；侵襲；轉移

(ChinJLabDiagn,2016,20:1623)

宮頸癌是最常見的女性生殖道惡性腫瘤，但隨著宮頸細胞學篩查體系的普及和完善，宮頸癌的發病率明顯的上升且趨于年輕化[1]。盡管目前臨床上主要采取治療為主，輔以放療或生物治療等多種治療相結合的方法已顯著降低了患者的死亡率，但宮頸癌的侵襲和轉移、局部復發仍是絕大多數患者治療失敗的主要原因，是臨床上解決的難點[2]。

結腸癌轉移相關基因1(metastasis-associated in colon cancer 1，MACC1)是由Stein等在2009年在結腸癌中發現并命名，定位于人7號染色體上，編碼852個氨基酸，并且發現此蛋白與結腸癌轉移、預后密切相關[3]。MACC1在多種腫瘤中異常表達，且與癌細胞的侵襲轉移密切相關[4-7]。周娜等[4]通過免疫組化檢測中-重度宮頸上皮內瘤變組織(CINⅡ-Ⅲ)，91例宮頸癌組織及10例正常宮頸組織，發現MACC1宮頸癌組織、CINⅡ-Ⅲ組織中的陽性表達率分別依次為83.5%、76.5%、80.2%、70.6%，均顯箸高于正常宮頸組織，且與組織學分化程度、脈管浸潤、肌層浸潤深度與宮頸癌盆腔淋巴結轉移有關。說明MACC1蛋白高表達是宮頸癌盆腔淋巴結轉移的獨立危險因素，但具體機制未知，因此本研究通過干擾MACC1基因表達后轉染到宮頸癌Hela細胞中，探討其對細胞侵襲轉移能力的影響及機制。

1 材料和方法

1.1 收集2014年6月至2015年6月江蘇省宜興人民醫院外科手術切除的宮頸癌組織10例標本及癌旁正常組織10例標本。

1.2 主要試劑和儀器 宮頸癌Hela細胞購自中國科學院細胞庫，目錄號TCHu187；兔抗MMP2，MMP9，E-cadherin，vimentin單克隆抗體(Epitmics公司)；兔抗MACC1單克隆抗體(Cell Signal Technology)；胎牛血清，DMEM培養基(Hyclone公司)；transwell 小室(Corning 公司)。迷你雙垂直電泳儀，迷你轉印電泳儀(北京六一儀器廠)；ChemiDocTM XRS凝膠成像系統(Bio-Rad公司)；

1.3 miRNA合成與轉染 在上海吉瑪制藥公司訂購合成siRNA-MACC1:上游引物：5’-CACCCUUCGUGGUAAUAAUTT-3’，下游引物：5’-AUUAUUACCACGAAGGGUGTT-3’。陰性對照組上游引物：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3，下游引物：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。根據細胞培養用品的不同以及上海吉瑪公司產品的操作說明推薦siRNA-MACC1與LipofectamineTM2000的比例進行轉染。

1.4 MTT法檢測細胞活力 將宮頸癌細胞Hela接種于96孔板，當細胞匯合度達到80%時，用LipofectamineTM2000分別轉染siRNA-MACC1和陰性對照。48 h后，加入20 μl 5 mg/ml MTT，繼續培養4 h，每孔加入150 μl DMSO，震蕩使結晶物充分溶解，于酶標儀560 nm處測OD值。1.5 細胞遷移實驗 將宮頸癌細胞Hela接種于6孔板當細胞匯合度達到80%時，用LipofectamineTM2000分別轉染siRNA-MACC1和陰性對照，轉染達到48 h后，將細胞消化加入transwell上室，下室用含 5%胎牛血清的DMEM培養基，繼續培養24 h，取出transwell小室，洗滌，多聚甲醛固定，結晶紫染色，倒置光學顯微鏡下計數5個視野穿膜細胞個數，計算平均每個視野的細胞數，即表示細胞的遷移能力。

1.6 細胞侵襲實驗 將Matrigel膠均勻平鋪于transwell 小室的微膜(5 μm)上，制成凝膠備用。其余步驟如1.5所示。計算平均每個視野的細胞數，即表示細胞的侵襲能力。

1.7 Western blot 在收集到的細胞中，加入適量的RIPA裂解液裂解可獲得總蛋白。根據BCA試劑盒對蛋白濃度進行測定。蛋白上樣，跑SDS凝膠電泳，后濕法轉膜。一抗溶液孵育，4℃過夜；二抗溶液中室溫孵育1-2 h。將膜取出漂洗，在膜上滴加ECL曝光液，在凝膠成像系統中曝光。用“Quantity one”軟件對各抗體條帶灰度值進行統計。

2 結果

2.1MACC1在宮頸癌組織中的表達Westernblot證實宮頸癌組織中MACC1的表達顯著高于癌旁正常組織的表達，其比值分別為(6.32±0.54)vs.(1.48±0.12)(P<0.01)。

2.2MACC1對宮頸癌細胞Hela活力的影響 與對照組比較，siRNA-MACC1組Hela細胞活力下降(P<0.01)。見圖1。

與對照組比較，**P<0.01

2.3MACC1對宮頸癌細胞Hela遷移和侵襲能力的影響 如圖2，圖3所示，通過transwell遷移和侵襲實驗發現，與對照組比較，siRNA-MACC1組中Hela細胞遷移和侵襲能力下降。

圖2 MACC1對宮頸癌細胞Hela遷移能力的影響

圖3 MACC1對宮頸癌細胞Hela侵襲能力的影響

2.4MACC1對宮頸癌細胞Hela中基質金屬蛋白酶(MMPs)表達的影響 與對照組比較，siRNA-MACC1組Hela細胞中MMP2，MMP9表達量下降(P<0.01)。見圖4。

2.5MACC1對宮頸癌細胞Hela中E-cadherin和vimentin表達的影響 與對照組比較，siRNA-MACC1組中Hela細胞中E-cadherin表達量上升(P<0.01)，vimentin表達量下降(P<0.01)。見圖5。

與對照組比較，**P<0.01

與對照組比較，**P<0.01

3 討論

宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤，在全球女性惡性腫瘤中發病率居第二位，僅次于乳腺癌。死亡率已占婦科惡性腫瘤的首位[1]。侵襲轉移是導致患者死亡的主要原因[2]。MMP是由結締組織合成分泌的鈣鋅依賴性蛋白水解酶家族，幾乎能降解除多糖外ECM的所有成分，因此在腫瘤的生長、侵襲轉移及血管形成過程中起著重要作用，是促進腫瘤浸潤生長的重要因素。MMP2是屬于明膠酶類的MMP，主要降解膠原和纖維連接蛋白，在宮頸癌中過表達，并與腫瘤浸潤程度及臨床分期有關[8]。MMP-9是由多種細胞分泌的一種蛋白水解酶，是MMP中分子量最大的酶，能夠降解細胞外基質和基底膜，從而增加細胞的運動能力，促進腫瘤的擴散和轉移，在宮頸癌組織中也高表達[9]。上皮來源的腫瘤細胞經歷上皮間質轉化(EMT)是腫瘤發生轉移的第一步，EMT可誘導原發部位的腫瘤播散，侵犯周圍組織，通過血液循環或淋巴循環轉移至遠處形成新的轉移灶，在此過程中腫瘤細胞的上皮標志物E-鈣粘蛋白(E-cadherin)消失，間質標志物波形蛋白(vimentin)表達增加，腫瘤細胞轉移能力加強。江文靜等[10]證實E-cadherin的陽性率均與宮頸癌的組織分化、臨床分期、有無淋巴結轉移以及術后復發有關。魏潔等[11]也發現vimentin的表達與宮頸癌淋巴轉移、分化程度密切相關。因此逆轉MMPs及EMT相關蛋白的表達，能抑制癌細胞的侵襲轉移。

MACC1是2009年Stein應用全基因組表達分析技術在結腸癌原發灶和轉移灶中發現的一個新基因，MACC1的表達是預測結腸癌轉移形成和無轉移生存期的獨立影響因素。MACC1在宮頸癌組織中的表達較癌旁正常組織中表達量提高[12]。我們通過Westernblot也證實了宮頸癌組織中MACC1的表達顯著高于癌旁正常組織。并且MACC1的表達與多種腫瘤的侵襲轉移能力有關。如MACC1通過直接靶向肝細胞生長因子受體c-Met表達從而抑制乳腺癌細胞的侵襲，轉移及抗血管生成能力[6]。Pichorner等[13]構建結直腸癌裸鼠移植瘤模型，轉染MACC1shRNA后，移植瘤生長速度減弱，轉移能力減弱。因此我們通過transwell遷移及侵襲實驗證實了當MACC1被下調后，可顯著抑制宮頸癌Hela細胞侵襲轉移能力。接著我們通過Westernblot進一步發現MACC1對于Hela細胞侵襲轉移能力的抑制作用與上調E-cadherin表達，下調MMP2、MMP9及vimentin表達有關。Zhang等[14]已證實MACC1在乳腺癌組織中過表達，當用siRNA干擾后，可抑制乳腺癌細胞的遷移及侵襲，是通過抑制c-Met及MMP2等蛋白的表達實現的。Zhen等[5]證實MACC1沉默后能通過上調E-cadherin表達，下調MMP9及vimentin表達，從而抑制大腸癌細胞HCT116的遷移、侵襲、轉移能力。Gao等[7]也證實MACC1-shRNA轉入肝癌細胞Huh7中，能顯著下調MMP2、MMP9的表達，從而降低癌細胞的遷移侵襲能力。充分說明了MACC1對于宮頸癌Hela細胞的侵襲、轉移能力的抑制作用，與上調E-cadherin、下調MMPs及vimentin表達有關。

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The effect of MACC1 on invasion and metastasis of cervical cancer cell

HUANGYing,WULi-ming,ZHANGLing,etal.

(ClinicalLab,YixingPeopleHospitalinJiangsuProvince,Yixing214211,China)

Objective To explore effect of metastasis-associated in colon cancer 1 (MACC1) on invasion and metastasis of cervical cancer cell Hela.Methods Western blot method was used to detect expression of 10 cases of cervical cancer tissues and normal tissues adjacent to carcinoma.siRNA-MACC1 was transfected into cervical cancer Hela cells by liposome.Cell viability was measured by MTT assay.The ability of cell migration and invasion was detected by transwell assay.The expression matrix metalloproteinase (MMPs) and epithelial mesenchymal transition (EMT) related protein was detected by western blot.Results The expression of MACC1 in cervical cancer tissues was higher than that in normal tissues (P<0.01).After siRNA-MACC1 and negative control were transfected into cervical cancer Hela cells by liposome,compared with control group,cell viability,migration and invasion ability was decreased (P<0.01),the expression of MMP2,MMP9 and vimentin was reduced (P<0.01),the expression of E-cadhetin was increased (P<0.01).Conclusion siRNA-MACC1 could inhibit invasion and metastasis of cervical cancer cell Hela,which was associated with reversing the expression of MMPs and EMT related proteins.

MACC1;cervical cancer;invasion;metastasis

國家自然科學基金(81001444)

1007-4287(2016)10-1623-04

R737.33

A

黃鶯(1983-)，女，碩士，中級檢驗師，研究方向：生化檢驗。

2015-10-24)