利用JMP軟件優(yōu)化威蘭膠發(fā)酵培養(yǎng)基

梁锏文，李智斌，陳柏銓

（廣東中科天元新能源科技有限公司，廣東廣州510640）

利用JMP軟件優(yōu)化威蘭膠發(fā)酵培養(yǎng)基

梁锏文，李智斌，陳柏銓

（廣東中科天元新能源科技有限公司，廣東廣州510640）

利用統(tǒng)計分析軟件JMP的試驗(yàn)設(shè)計（DOE）功能（包括Plackett-Burman設(shè)計、析因設(shè)計、中心組合設(shè)計，預(yù)測刻畫等）對威蘭膠發(fā)酵菌株Alcaligenessp.Y5的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，得到一組最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方：葡萄糖52.9 g/L、牛肉膏4.0 g/L、K2HPO4·7H2O 2.2g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L，CaCO32.0 g/L，吐溫80 0.5 g/L。優(yōu)化后威蘭膠產(chǎn)量由初始的15.72 g/L提高到26.58g/L，提高了69.08％。

JMP；威蘭膠；優(yōu)化；Plackett-Burman設(shè)計；析因設(shè)計；預(yù)測刻畫

威蘭膠（welan gum）是由某些產(chǎn)堿桿菌Alcaligenes sp.以及鞘氨醇單胞菌Sphingomonas sp.合成的微生物雜多糖［1］，是美國斯比凱可公司（CPKelco）20世紀(jì)80年代繼黃原膠、結(jié)冷膠之后開發(fā)的第3代微生物胞外多糖之一，其分子量高達(dá)數(shù)百萬。它的結(jié)構(gòu)骨架由D-葡萄糖、D-葡糖醛酸、D-葡萄糖和L-鼠李糖重復(fù)單元構(gòu)成，側(cè)鏈由單一的L-甘露糖或L-鼠李糖構(gòu)成［2］，結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1　威蘭膠結(jié)構(gòu)式Fig.1 Thestructureofwelan gum

威蘭膠水溶液具有假塑性流體特征，其低濃度水溶液具有很高的粘度，并具有良好的穩(wěn)定性，溫度升高至150℃時，其黏度基本不變，其耐溫極限值比黃原膠高20℃～30℃。威蘭膠水溶液對酸、堿穩(wěn)定，其黏度在pH2～13范圍內(nèi)基本不受影響［3-4］；威蘭膠溶液具有獨(dú)特的剪切稀釋性能，這一點(diǎn)在石油鉆井中發(fā)揮突出的作用［5］。威蘭膠溶液的獨(dú)特性質(zhì)超越其它多糖，可作為增稠劑、懸浮劑、乳化劑、穩(wěn)定劑、潤滑劑、成膜劑和粘合劑應(yīng)用于石油、混凝土、食品、油墨等工業(yè)［1，6-8］。目前僅美國Kelco公司商業(yè)化生產(chǎn)威蘭膠，國內(nèi)尚處于實(shí)驗(yàn)室研究的起步階段。

培養(yǎng)基優(yōu)化的方法很多，除單因素試驗(yàn)優(yōu)化外，還包括正交設(shè)計，均勻設(shè)計，響應(yīng)面優(yōu)化等方法［9］，許多試驗(yàn)設(shè)計優(yōu)化和分析都可借助一些商業(yè)軟件如Design Expert、DPS、SAS、SPSS、Minitab、JMP等來完成。其中JMP是SAS推出的一種交互式可視化統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)軟件，作為一款優(yōu)秀的圖形化統(tǒng)計分析軟件，其試驗(yàn)設(shè)計（DOE）內(nèi)容豐富（包括定制設(shè)計、篩選設(shè)計、響應(yīng)面設(shè)計、非線性設(shè)計、空間填充設(shè)計、混料設(shè)計、加速壽命設(shè)計、擴(kuò)充設(shè)計等），試驗(yàn)設(shè)置非常靈活，試驗(yàn)分析功能強(qiáng)大（模型擬合、圖形展示、數(shù)據(jù)挖掘、模擬器等），利用JMP的試驗(yàn)設(shè)計可大大提高試驗(yàn)效率。本文以分離篩選的威蘭膠發(fā)酵菌株為對象，利用JMP軟件試驗(yàn)設(shè)計（DOE）功能對其發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行設(shè)計優(yōu)化，得到最佳培養(yǎng)基配方，并應(yīng)用于發(fā)酵罐發(fā)酵試驗(yàn)，驗(yàn)證實(shí)際效果，為進(jìn)一步擴(kuò)大試驗(yàn)提供參考。

1　材料與方法

1.1菌株與培養(yǎng)基

菌株（產(chǎn)堿桿菌Alcaligenessp.Y5）：廣東省生物液體燃料（中科天元）工程技術(shù)研究中心實(shí)驗(yàn)室保藏。

斜面培養(yǎng)基（g/L）：牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl 5，pH 7.0±0.2。

種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖10，蛋白胨10，酵母粉5，K2HPO4·7H2O 2，MgSO4·7H2O 0.1，pH 7.0±0.2。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖40，蛋白胨4，K2HPO4·7H2O 2，MgSO4·7H2O 0.1，CaCO33.0，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，吐溫80 0.5，pH 7.0±0.2。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)方法

1.2.1.1種子培養(yǎng)

250mL三角瓶裝種子培養(yǎng)基50mL，接種活化好的菌種斜面1環(huán)～2環(huán)，30℃，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min培養(yǎng)18 h～20 h。

1.2.1.2發(fā)酵培養(yǎng)

250mL三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基50mL，按5％（體積分?jǐn)?shù)）的接種量接種培養(yǎng)好的種子液到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃，搖床轉(zhuǎn)速250 r/min培養(yǎng)72 h。

1.2.2試驗(yàn)分析方法

1.2.2.1威蘭膠產(chǎn)量測定

發(fā)酵液經(jīng)80℃水浴滅活20min，冷卻后加入2倍體積的95％乙醇，劇烈震蕩至出現(xiàn)絮狀沉淀，4℃靜置過夜，8 000 r/min離心20min，棄去上清液，再用95％乙醇洗滌沉淀2次，將沉淀物于60℃烘干至恒重，電子天平稱重。

1.2.2.2黏度的測定

用SNB-1數(shù)字粘度計（上海精天），4號轉(zhuǎn)子，30 r/min，室溫測定發(fā)酵液黏度。

1.2.3試驗(yàn)優(yōu)化步驟及軟件

首先采用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計從眾多發(fā)酵培養(yǎng)基組分中篩選出影響威蘭膠產(chǎn)量的重要影響因子；再通過析因設(shè)計對篩選的重要因子進(jìn)行初步優(yōu)化，確定最佳范圍；最后利用中心組合設(shè)計進(jìn)行高級優(yōu)化，并利用JMP的刻畫器預(yù)測出最佳培養(yǎng)基組分及產(chǎn)量，最后對該培養(yǎng)基組分進(jìn)行驗(yàn)證。

試驗(yàn)設(shè)計及分析軟件為JMP 9.0試用版。

2　結(jié)果與討論

2.1Plackett-Burman設(shè)計

Plackett-Burman設(shè)計是一種兩水平的試驗(yàn)優(yōu)化方法，可以用最少的試驗(yàn)次數(shù)達(dá)到使因子的主效果得到盡可能精確的估計，適用于從眾多的考察因子中快速有效地篩選出最為重要的幾個因子。本文從初始發(fā)酵培養(yǎng)基組分出發(fā)，各組分及水平設(shè)置見表1。利用JMP試驗(yàn)設(shè)計中的篩選設(shè)計，響應(yīng)Y值為威蘭膠產(chǎn)量，添加8個連續(xù)因子，設(shè)計類型為Plackett-Burman，添加3個中心點(diǎn)，試驗(yàn)共15組，所得設(shè)計表及結(jié)果見表2。

表1　Plackett-Burm an設(shè)計中培養(yǎng)基組分及水平設(shè)置Table1 M edia componentsand test levels for Plackett-Burm an experim ent

表2　Plackett-Burman試驗(yàn)及結(jié)果Table2 Plackett-Burman experimentand results

Plackett-Burman試驗(yàn)參數(shù)估計見表3。

表3　Plackett-Burman參數(shù)估計Table3 Param etersestimatesof Plackett-Burm an experiment

從表3中可以看出，R2=0.990 9，調(diào)整R2=0.978 9，失擬P=0.653 7＞0.05，一階模型擬合良好。重要影響因子且為正效應(yīng)的有葡萄糖，牛肉膏，蛋白胨和K2HPO4·7H2O（P＜0.05），其中牛肉膏和蛋白胨均為氮源，考慮到成本因素，后續(xù)試驗(yàn)采用牛肉膏作為氮源；培養(yǎng)基組分中FeSO4·7H2O為重要影響因子（P＜0.05）且為負(fù)效應(yīng)，其低水平為0，故從培養(yǎng)基中剔除；其它因子影響不大，都取低水平進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.2析因設(shè)計

從2.1的Plackett-Burman試驗(yàn)可知發(fā)酵培養(yǎng)基組分中葡萄糖、牛肉膏、K2HPO4·7H2O為正效應(yīng)，提高各組分用量可以提高威蘭膠產(chǎn)量，由于試驗(yàn)因素較少，可采用JMP給定的完全析因設(shè)計方案，添加3個中心點(diǎn)，試驗(yàn)共11組，試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果見表4。

表4　析因試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果Tab le4 Factorialexperim entand results

根據(jù)表4試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行一階模型擬合，結(jié)果見表5。

表5　析因設(shè)計一階模型參數(shù)估計Table5 Param etersestimatesof first-orderm odel from factorial experim ent

由表5可知，R2=0.566 4，調(diào)整R2=-0.445 2，失擬P=0.009 9＜0.05，說明一階模型擬合較差，存在彎曲效應(yīng)。

重新對表4結(jié)果運(yùn)行篩選腳本（分析-建模-篩選），結(jié)果見表6。

表6　析因設(shè)計因子篩選結(jié)果Table6 Factor screening results from factorialexperiment

從表6中可以看出，影響顯著的因子有葡萄糖X1，K2HPO4·7H2O X4和葡萄糖的二次效應(yīng)X12，其它因子影響不顯著（其中牛肉膏為負(fù)效應(yīng)，后續(xù)試驗(yàn)保持低水平）。利用這3個重要因子重新構(gòu)建模型，結(jié)果見表7。

表7　析因設(shè)計二階模型參數(shù)估計Tab le7 Param etersestimatesof second-orderm odel from factorialexperiment

由表7可知，R2=0.987 7，調(diào)整R2=0.982 4，失擬P= 0.356 6＞0.05，說明二階模型擬合良好，二階方程為Y= 25.20+3.43X1-0.51X4-5.78X12。

利用JMP的刻畫器功能，以最大化期望（威蘭膠產(chǎn)量最大化）進(jìn)行預(yù)測，如圖2所示。

圖2　析因設(shè)計威蘭膠產(chǎn)量預(yù)測Fig.2 Forecastofwelan gum production from factorialexperiment

由圖2所示，當(dāng)培養(yǎng)基中葡萄糖為53.0 g/L，K2HPO4·7H2O為2.0 g/L，預(yù)計威蘭膠產(chǎn)量達(dá)到最高，為（26.22±0.83）g/L（期望值為0.857 9）。

2.3中心組合設(shè)計

通過析因試驗(yàn)的初步優(yōu)化結(jié)果可知葡萄糖和K2HPO4·7H2O為重要影響因子，且濃度分別為53.0g/L、2.0 g/L時，預(yù)計威蘭膠產(chǎn)量達(dá)到最高，故在此基礎(chǔ)上進(jìn)行中心組合設(shè)計，設(shè)計表及結(jié)果見表8。

表8　中心組合設(shè)計及結(jié)果Table8 Central compositon design and results

中心組合設(shè)計參數(shù)估計和方差分析見表9和表10。

由表9、表10可知，R2=0.973 1，調(diào)整R2=0.939 4，失擬P=0.169 5＞0.05，說明模型擬合良好，二階方程為Y=26.56+0.01X1+1.13X4-0.16X1X4-1.55X12-1.17X42。

表9　中心組合設(shè)計參數(shù)估計Tab le9 Parametersestimatesof centralcom positon design

表10　中心組合設(shè)計方差分析Table10 Analysisof varianceof centralcom positon design

再次利用JMP刻畫器進(jìn)行預(yù)測，如圖3和圖4。

圖3　中心組合設(shè)計威蘭膠產(chǎn)量預(yù)測Fig.3 Forecastofwelan gum production from centralcom positon design

圖4　響應(yīng)面圖Fig.4 Responsesurfacesp lot

由圖2和圖3可知，當(dāng)培養(yǎng)基中葡萄糖為52.9g/L，K2HPO4·7H2O為2.2 g/L，預(yù)計威蘭膠產(chǎn)量為（26.83± 0.72）g/L（期望值為0.949 1），另外，從圖2可以看出，當(dāng)葡萄糖含量超過52.89 g/L時，產(chǎn)量不再提高，而呈下降趨勢，這可能有二方面原因，一是過高的葡萄糖濃度抑制了威蘭膠的合成，二是威蘭膠發(fā)酵過程中黏度升高，影響了培養(yǎng)基中氧的傳遞，氧成為威蘭膠發(fā)酵的限制因子［10］，導(dǎo)致產(chǎn)量不再增高。

通過上述優(yōu)化步驟，最終得出的威蘭膠發(fā)酵配方為（g/L）：葡萄糖52.9，牛肉膏4.0，K2HPO4·7H2O 2.2，MgSO4·7H2O 0.1，CaCO32.0，吐溫80 0.5。經(jīng)過3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)威蘭膠產(chǎn)量為（26.58±0.16）g/L，與預(yù)測值進(jìn)行均值比較P=0.593 1＞0.05，無顯著性差異，證明了與JMP預(yù)測結(jié)果相符。

3　結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)，Plackett-Burman設(shè)計，析因設(shè)計，中心組合設(shè)計以及利用JMP軟件的預(yù)測刻畫功能，得到最佳威蘭膠發(fā)酵培養(yǎng)基配方為葡萄糖52.9 g/L、牛肉膏4.0 g/L、K2HPO4·7H2O 2.2 g/L、MgSO4·7H2O 0.1 g/L，CaCO32.0 g/L，吐溫80 0.5 g/L。優(yōu)化后威蘭膠產(chǎn)量由初始的15.72 g/L提高到26.58 g/L，提高了69.08％。

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Optim ization of Fermentation Media for Welan Gum Using JMP

LIANG Jian-wen，LI Zhi-bin，CHEN Bai-quan
（Guangdong Zhongke Tianyuan New Energy Scienceand Technology Co.，Ltd.，Guangzhou 510640，Guangdong，China）

The statistical analysis soft ware JMP（its function include sPlackett-Burman design，F(xiàn)actorialdesign，Central compositon design，Prediction Profiler etal.）wasapplied to optimize the fermentationmedium ofwelan gum by Alcaligenes sp.Y5.The optimal composition of themedium was determined as glucose 52.9 g/L，beef extract4.0g/L，K2HPO4·7H2O 2.2g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，CaCO32.0g/L，Tween800.5g/Lbyusing theoptimised medium，thewelan gum production increased from 15.72 g/L to26.58 g/L，with an increaseof69.08％.

JMP；welangum；optimization；Plackett-Burmandesign；Factorialdesign；Predictionprofiler

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.18.024

梁锏文（1980—），男（漢），碩士，研究方向：工業(yè)微生物。

2015-11-04