水杉葉中抗氧化活性物質(zhì)提取工藝研究

王新，鄭萍，馬小媛，高紅旗，董安榮，蔣彩云，*

（1.江蘇經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院工程技術(shù)學(xué)院江蘇省食品安全工程技術(shù)研發(fā)中心，江蘇南京211168；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122；3.上海清軒生物科技有限公司，上海201612）

水杉葉中抗氧化活性物質(zhì)提取工藝研究

王新1，鄭萍1，馬小媛2，高紅旗3，董安榮1，蔣彩云1，*

（1.江蘇經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院工程技術(shù)學(xué)院江蘇省食品安全工程技術(shù)研發(fā)中心，江蘇南京211168；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122；3.上海清軒生物科技有限公司，上海201612）

主要研究水杉葉中抗氧化物質(zhì)提取工藝，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定最佳的提取工藝為：超聲提取，提取溶劑為75％的乙醇，提取溫度60℃，料液比為1∶28（g/mL），提取時(shí)間1.5 h。該條件很好的保護(hù)了水杉提取物的多種生物活性，為合理開發(fā)和利用水杉資源打下了良好的基礎(chǔ)。

水杉；抗氧化；超聲輔助提取；DPPH·

水杉是一種古老的孑遺單種屬植物，素有“活化石”之稱。《中國中藥資源志要》有過這樣的記載，水杉葉、果實(shí)有清熱解毒、消炎止痛的功效，能用于癰瘡腫痛、癬瘡等癥狀［1-2］。現(xiàn)代藥理研究表明水杉中的化學(xué)成分具有抗心腦血管疾病作用、抗菌作用和抗腫瘤作用等。水杉落葉中的化學(xué)成分比較復(fù)雜，各自的功能也不同，現(xiàn)在已分離出主要成分為黃酮類，萜類（蒎烯、檸檬烯等），糖類，木質(zhì)素類等［3-4］。本文通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，研究水杉葉中抗氧化物質(zhì)的提取工藝。從水杉中提取、精制而得到的產(chǎn)品對人體的多種疾病往往具有很好的治療、預(yù)防等藥理作用和保健功能。提取的抗氧化活性物質(zhì)已用于保健品、食品和藥品等領(lǐng)域。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

水杉葉粉末：上海清軒生物科技有限公司；無水乙醇：深圳市華昌化工有限公司；正丁醇：佛山市恒榮化工有限公司；1，3-丁二醇：廣州勝欣化工科技有限公司；1，1-二苯基苦基苯肼（DPPH）：啟東亞太化工廠有限公司；抗壞血酸（VC）：斯百全化學(xué)（上海）有限公司，都為分析純，試驗(yàn)用水為去離子純凈水。

1.2儀器與設(shè)備

FW100萬能高速粉碎機(jī)：蘇州江東精密儀器有限公司；DGF 30/23-mA電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：蘇州銀邦節(jié)能電熱設(shè)備有限公司；FA2104N電子分析天平：上海平軒科學(xué)儀器有限公司；KQ-100E超聲波清洗器：昆山市超聲波有限公司；SZCL數(shù)顯智能控溫磁力攪拌器：上海越眾儀器設(shè)備有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；UV-1801紫外分光光度計(jì)：讓奇（上海）科技科技有限公司。

1.3方法

1.3.1DPPH·法評價(jià)水杉葉提取液的抗氧化性

1.3.1.1DPPH溶液的配制

精確稱取39 mg DPPH，用無水乙醇溶解定容到250 mL容量瓶中，得到的DPPH溶液的濃度為0.4mmol/L，將配制好的DPPH溶液移至棕色試劑瓶中置于暗處儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.2DPPH·清除率的計(jì)算

本試驗(yàn)采用二苯基苦基苯肼（簡稱DPPH）分光光度法評價(jià)水杉葉中提取物的抗氧化活性，此方法是評價(jià)自由基清除效果、挑選天然抗氧化劑最常用的方法［5］。

DPPH·是一種穩(wěn)定的脂性自由基，其乙醇溶液呈紫色，在517 nm處有較大吸收峰。在有自由基清除劑存在時(shí)，DPPH·的孤對電子被配對，從而使其褪色，在517 nm處的吸收峰會相對減弱，褪色程度與其接受電子呈定量關(guān)系。通過紫外可見分光光度計(jì)檢測DPPH·與樣液反應(yīng)后的吸光度值的變化，從而建立樣品清除自由基的能力的評價(jià)體系，進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)。具體操作步驟如下：

精密量取2mL提取液和2mLDPPH溶液到比色管，即為反應(yīng)溶液，將震蕩搖勻后的反應(yīng)溶液置于暗處避光反應(yīng)30min后，于517 nm波長處測定吸光度值（Abs）得到A反應(yīng)溶液；精密量取2mL提取液和2mL無水乙醇溶劑到比色管，即為空白溶液，將震蕩搖勻后的空白溶液置于暗處避光反應(yīng)30min后，于517 nm波長處測定吸光度值（Abs）得到A空白溶液；液精密量取提取溶劑2mL和2mLDPPH溶液到比色管，即為空樣溶液，將震蕩搖勻后的空樣溶液置于暗處避光反應(yīng)30min后，于517 nm波長處測定吸光度值（Abs）得到A空樣溶液。

DPPH·清除率/％＝［1-（A反應(yīng)溶液-A空白溶液）/A空樣溶液］×100

1.3.2水杉葉中活性成分的提取

將烘干至恒重的水杉葉樣品用粉碎機(jī)粉碎后，稱取1.0 g水杉葉粉末分別放入相應(yīng)的提取劑中，在不同的設(shè)置條件下進(jìn)行提取，得到含水杉活性成分的提取溶液。

1.3.3水杉葉總抗氧化能力的測定

1.3.3.1VC標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

用純凈水作為溶劑配制VC溶液，濃度為0.02mg/mL。采用逐級稀釋的方法，得到濃度梯度分別為0.004、0.008、0.010、0.012、0.014、0.016mg/mL的VC標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.3.2VC標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

將提取液換成不同濃度的VC標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3.3.1中的流程進(jìn)行操作，與517 nm波長下測定相應(yīng)的吸光度值，得出對應(yīng)的DPPH·清除率。

1.3.3.3總抗氧化能力的測定

根據(jù)最佳工藝提取水杉葉粉末，吸取提取液0.5mL稀釋定容到100mL容量瓶中，測定對DPPH溶液的清除率，再根據(jù)VC與DPPH·的線性方程計(jì)算出每克水杉葉樣品抗氧化成分相當(dāng)于含有VC的量。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)

2.1.1不同提取劑對水杉葉中抗氧化物提取效果的影響

稱1.0 g水杉葉粉末于30mL溶劑中，溶劑分別采用純水、無水乙醇、75％乙醇、50％乙醇、1，3-丁二醇、正丁醇在40℃下超聲0.5 h，抽濾之后得到樣品的提取液。得到的提取液進(jìn)行稀釋后，與DPPH·在暗處反應(yīng)30min（下同），測得的試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

圖1　不同提取溶劑提取抗氧化物效果Fig.1 Antioxidanteffectof extraction of differentextraction solvents

從圖1中可以看出75％的乙醇提取效果最好，無水乙醇提取效果次之，而純水提取效果最差。這是由于黃酮類、萜類等的活性物質(zhì)一般都是易溶于乙醇、甲醇等的有機(jī)溶劑，不溶于水，因此，水杉葉中抗氧化物提取的最佳提取溶劑為乙醇。

2.1.2乙醇不同濃度對水杉葉中抗氧化物提取效果的影響

稱1.0g水杉于30mL溶劑中，溶劑分別采用60％、70％、75％、80％、90％的濃度，在40℃下超聲0.5 h，抽濾之后得到樣品的提取液，測得的試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖2　乙醇不同濃度提取抗氧化物效果Fig.2 Antioxidanteffectof different concentrationsof ethanol extract

從圖2中可以看出75％的乙醇提取效果最好，70％的乙醇提取效果次之，而90％的提取效果最差。這與高鵬、牟新利等人做的研究結(jié)論是相符的［6］，在他們的研究中提到：用95％乙醇只能將黃酮甙元提取完全，黃酮甙的提取效率低，成本高，50％乙醇提取率較低，用75％的乙醇既可以提取出黃酮甙元也能提取出黃酮甙，成本適中，提取率也有保證，安全無毒，操作方便，適合工業(yè)化生產(chǎn)，因此，本文中水杉葉抗氧化物提取的乙醇最佳提取濃度是75％。

2.1.3不同提取方式對水杉葉中抗氧化物提取效果的影響

稱1.0 g水杉葉粉末加入到30mL的75％乙醇中，在40℃下分別采用超聲波輔助、水浴振蕩、靜置、磁力攪拌4種提取方式進(jìn)行提取，提取時(shí)間為0.5 h，得出的結(jié)論如圖3。

圖3　不同提取方法提取抗氧化物效果Fig.3 Antioxidanteffectof thedifferentextractionmethods

從圖3中可以看出，超聲波提取水杉中抗氧化物效果最好，水浴振蕩效果次之，而靜置的效果最差。同傳統(tǒng)的提取方法相比，超聲波提取具有保護(hù)藥物活性成分、提取能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)［7］。因此，水杉葉中活性物質(zhì)提取的最佳提取方法是超聲波提取。

2.1.4料液比對水杉中抗氧化物提取效果的影響

稱1.0 g水杉粉末加入不同體積的75％乙醇，提取溫度為40℃，超聲提取時(shí)間0.5 h的條件下，依次在料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）的條件下進(jìn)行提取，如圖4所示。

圖4　不同料液比提取抗氧化物效果Fig.4 Antioxidanteffectof different liquid ratio extraction

料液比1∶25（g/mL）效果最好，1∶30（g/mL）效果次之，而1∶10（g/mL）效果最差。料液比低的時(shí)候，原料并沒有提取完全，所以總的抗氧化能力比較低；而料液比比較大的時(shí)候，不僅浪費(fèi)提取溶劑，而且浪費(fèi)能源、熱能等。因此，水杉葉中抗氧化物提取的最佳料液比是1∶25（g/mL）。

2.1.5不同提取時(shí)間對水杉葉中抗氧化物提取效果的影響

稱1.0 g水杉葉粉在25mL 75％乙醇溶液中，溫度為40℃的條件下，依次在0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 h的時(shí)間下進(jìn)行超聲提取，測定其抗氧化能力，所得的抗氧化效果如圖5所示。

圖5　不同提取時(shí)間提取抗氧化物效果Fig.5 Antioxidanteffectof extraction of differentextraction time

由圖5可以看出，提取時(shí)間0.5 h的提取效果最好，5 h效果最差。時(shí)間越短對活性物質(zhì)提取效果越好，時(shí)間越長破壞水杉成分，如葉綠素等的。因此，水杉葉中抗氧化物提取的最佳提取時(shí)間為0.5 h。

2.1.6不同提取溫度對水杉葉中抗氧化物提取效果的影響

稱水杉葉粉1.0 g于25mL提取液濃度為75％的乙醇溶液，提取時(shí)間為0.5 h條件下，依次在溫度為40、50、60、70、80℃下進(jìn)行提取，其結(jié)果如圖6所示。

圖6　不同提取溫度提取抗氧化物效果Fig.6 Antioxidanteffectof extraction of differentextraction tem perature

由圖6可知，60℃提取效果最好，80℃效果最差。這是由于溫度升高，有利于樣品中的黃酮類化合物擴(kuò)散到溶劑中，溫度高于60℃，超過乙醇的沸點(diǎn)，大部分乙醇以氣態(tài)存在，溶劑總量減少，所以提取率反而降低［8］。因此，水杉葉中抗氧化物提取的最佳提取溫度為60℃。

2.2正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取影響水杉葉中抗氧化物質(zhì)提取效果主要因素，每個(gè)因素選取3個(gè)水平，所選取的各水平見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1　正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table1 Factorsand levelsof orthogonal test design

表2　L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果Table2 The resultsof L9（34）orthogonal test

續(xù)表2 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果Continue table2 The resultsof L9（34）orthogonal test

根據(jù)正交試驗(yàn)中的最佳提取條件，稱1.0 g取3份水杉葉粉末樣品，分別加入28mL的75％乙醇，并在溫度為60℃下，超聲輔助提取1.5 h得到提取液，分別測定水杉提取物對清除DPPH·的結(jié)果為：68.3％；69.2％；66.9％，即平均抗氧化效果為：68.1％。

2.3水杉葉總抗氧化能力的測定

利用DPPH·分光度法分別測定已知標(biāo)準(zhǔn)濃度的VC的抗氧化性，以DPPH·清除率為縱坐標(biāo)，VC濃度為橫坐標(biāo)，建立相對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。DPPH·在不同濃度的VC標(biāo)準(zhǔn)液下光譜圖的變化見圖7。

圖7　DPPH·溶液在不同VC濃度下的吸收光譜圖Fig.7 Theabsorption spectra of DPPH·solution at different VCconcentrations

由圖7可知，隨著VC濃度的不斷增加，對DPPH·的清除能力也隨之加強(qiáng)，在517 nm處吸收峰的強(qiáng)度降低。

VC溶液濃度與DPPH·清除率的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖8。

從圖8中可知，VC（x）濃度和DPPH·清除率（y）之間符合線性關(guān)系，其線性方程為y=4 496.07x-1.896（R=0.999 1）。

以VC作為標(biāo)準(zhǔn)參照物，采用DPPH·分光光度法建立了VC抗氧化性的評價(jià)體系，并利用此體系作為水杉葉提取物總抗氧化能力的測定依據(jù)，進(jìn)而計(jì)算出每克水杉葉樣品中抗氧化活性成分含有的VC當(dāng)量。

稱取1.0 g的水杉樣品，加入28mL 75％乙醇，在最佳溫度60℃和時(shí)間1.5 h條件下提取得到提取液，測定提取液對DPPH·的清除率，由VC溶液與DPPH·溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=4 496.07x-1.896（R=0.999 1），計(jì)算出每克水杉樣品中抗氧化成分相當(dāng)于VC的含量為：63.2mg。

圖8　VC溶液濃度與DPPH·清除率的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.8 The standard curveof the concentration of VCand DPPH· removal rate

3　結(jié)論

通過超聲提取法對水杉葉中的抗氧化活性物質(zhì)進(jìn)行了提取，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，考查了不同因素如提取劑濃度、提取溫度、提取時(shí)間、料液比等對水杉葉抗氧化成分提取效果的影響，其影響主次為：提取溫度＞料液比＞提取溶劑＞提取時(shí)間。確定了水杉葉中的抗氧化活性物質(zhì)的最佳提取工藝條件為：提取溶劑為75％的乙醇，提取溫度60℃，料液比為1∶28（g/mL），提取時(shí)間1.5 h。

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Study on the Extraction Technology of the Antioxidant Com ponents from M etasequoia Leaves

WANG Xin1，ZHENG Ping1，MA Xiao-yuan2，GAO Hong-qi3，DONG An-rong1，JIANG Cai-yun1，*
（1．Jiangsu Engineering and Research Center of Food Safety，Departments of Engineering and Technology，Jiangsu Institute ofCommerce，Nanjing 211168，Jiangsu，China；2.Schoolof Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，Jiangsu，China；3．ShanghaiQingxuan Biological Technology Co.，Ltd.，Shanghai 201612，China）

Extraction process of the antioxidant components from metasequoia leavesare studied in this paper. Thebestextractconditionswere identified by single factor testand orthogonal test.Theextractmethod，solvent，the temperature，the ratio ofsolvent to rosemary and the timewere ultrasonic extraction，75％ethanol，60℃，1∶28（g/mL）and 1.5 h respectively.The condition is very good to protecta variety ofbiologicalactivity of the extracts frommetasequoia，rationaldevelopmentand utilization ofmetasequoia resourceshave laid a good foundation.

metasequoia；antioxidant；ultrasonicassistedextraction；DPPH·

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.18.009

國家自然科學(xué)基金青年基金（31401665）；江蘇省高校青藍(lán)工程（QL2012006）；江蘇省高等職業(yè)院校高級訪問工程師計(jì)劃（2014FG033）；江蘇經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院重大研究課題資助項(xiàng)目（JSJM15005）

王新（1982—），女（滿），講師，碩士研究生，研究方向：功能食品的開發(fā)。

2015-11-05