低劑量照射誘導人淋巴細胞53BP1焦點形成的劑量-效應關系研究*

徐 巖 封江彬 陸 雪 李 爽 高 玲 田 梅 蔡恬靜 劉青杰*

低劑量照射誘導人淋巴細胞53BP1焦點形成的劑量-效應關系研究*

徐 巖①封江彬①陸 雪①李 爽①高 玲①田 梅①蔡恬靜①劉青杰①*

目的：探討低劑量60Coγ射線照射誘導人永生化淋巴細胞AHH-1中P53結合蛋白1（53BP1）焦點水平與照射劑量之間的關系。方法：用60Coγ射線照射AHH-1細胞，照射劑量分別為0 mGy、10 mGy、25 mGy、50 mGy、100和200 mGy，吸收劑量率為20 mGy/min，37 ℃修復30 min后進行免疫熒光染色，利用激光共聚焦掃描顯微鏡分析細胞中53BP1焦點形成情況。結果：在劑量為0～200 mGy的60Coγ射線照射30 min后，AHH-1細胞中53BP1焦點在每個細胞中的數目為0～4個，均符合泊松分布。從50 mGy照射劑量開始53BP1焦點水平顯著性增加，且焦點水平與照射劑量具有劑量-效應關系，劑量-效應曲線為y=（0.03×10-2）x+2.32×10-2（R2=0.9236，P＜0.01）。結論：在低劑量電離輻射作用下，53BP1焦點水平具有較好的劑量-效應關系。

低劑量照射；60Coγ射線；免疫熒光；P53結合蛋白1

［First-author’s address］ China CDC Key Laboratory of Radiological Protection and Nuclear Emergency， National Institute for Radiological Protection， Chinese Center for Disease Control and Prevention， Beijing 100088， China.

P53結合蛋白1（53BP1）是重要的DNA損傷修復蛋白，當細胞受到電離輻射作用時，53BP1會在DNA雙鏈斷裂處募集，表現為經過免疫熒光染色后可在激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察到發光的焦點［1］。53BP1可以通過調節非同源性末端連接和同源重組修復兩種主要的雙鏈斷裂修復途徑的選擇，通過多種組蛋白修飾來結合損傷的染色質，阻斷5′端的末端切除并且促進染色質的運動和聯會等方式參與到DNA損傷修復［2］。本研究利用低劑量60Coγ射線照射永生化淋巴細胞系AHH-1，通過探索53BP1焦點發生率與受照劑量的關系，為探討53BP1作為低劑量電離輻射標志物提供進一步理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

激光共聚焦掃描顯微鏡型號為LSM700（德國，Zeiss公司）；磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）、4%多聚甲醛以及4`，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，激發波長：345 nm；發射波長：455 nm）等其他試劑均為國產分析純。53BP1兔多克隆抗體購自美國abcam公司；Alexa fluor 594（激發波長：591 nm；發射波長：614 nm）驢抗兔IgG購自美國Jackson公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）購自中國金耀生物公司；永生化淋巴細胞系AHH-1購于北京曼哈頓醫學生物技術公司。

1.2 細胞培養和照射

AHH-1細胞在含體積分數為10%小牛血清、105U/L青霉素和質量濃度水平為100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養基中，置于37 ℃飽和濕度的含體積分數為5%的CO2培養箱中培養至對數生長期。將處于對數生長期的淋巴細胞換液，在室溫下用60Coγ射線進行照射，吸收劑量分別為0 mGy、10 mGy、25 mGy、50 mGy、100 mGy和200 mGy，照射源由中國計量院提供，放射性活度為9.25×1010Bq，吸收劑量率為20 mGy/min，吸收劑量校準溯源于中國計量院國家級實驗室，照射野直徑為99.3 mm，源靶距為1.24 m。照射后置于37 ℃恒溫箱培養30 min進行試驗。

1.3 免疫熒光染色技術檢測53BP1焦點形成

將AHH-1細胞用1×PBS室溫下洗5 min×3遍，4%多聚甲醛溶液于室溫下固定15 min，1×PBS洗5 min×3遍。0.2%的TritonX-100室溫下破膜15 min，1×PBS洗5min×3遍。37 ℃環境下用3%BSA封閉30 min，1×PBS洗5 min×3遍。加入53BP1兔多克隆抗體（用1%BSA按照1∶100稀釋），4 ℃孵育過夜。第2 d取出，1×PBS洗5 min×3遍。加入熒光二抗37 ℃孵育1 h，1×PBS洗5 min×3遍。加入50 μl 1×PBS，將細胞打勻，滴在玻片上，室溫下自然晾干，用DAPI AF封片10 min后上機觀察53BP1焦點數并做記錄（Pinhole=54 μm，Digital gain=1）。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統計分析，各組53BP1焦點的分布采用單樣本K-S檢驗，P＞0.05為符合泊松分布。各組間53BP1焦點發生率的差異用U檢驗，53BP1焦點發生率的劑量-效應曲線用一元線性回歸分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫熒光技術觀測53BP1焦點形成

用免疫熒光技術觀察AHH-1細胞，在0 mGy、10 mGy、25 mGy、50 mGy、100 mGy和200 mGy6個劑量水平各觀察1000個細胞，分析53BP1的焦點發生水平（焦點數/細胞），可觀察到永生化淋巴細胞AHH-1受低劑量電離輻射作用30 min后，包括對照組在內的各劑量水平照射組均可見53BP1焦點形成，為0～4個焦點/細胞（如圖1所示）。

圖1 60Co γ射線照射AHH-1細胞中53BP1焦點形態圖(×1000)

經K-S檢驗各受照劑量組漸進顯著性均＞0.05，表明53BP1焦點在細胞內分布符合泊松分布。形成的焦點數目除10 mGy照射組有所減少，其余組隨吸收劑量的增加而升高；各照射組與未照射組比較，在50 mGy以上各組均有統計學意義（U=3.349，U=4.061，U=5.966；P＜0.01），見表1。

2.2 低劑量照射誘導的53BP1焦點水平的劑量-效應曲線60Coγ射線照射AHH-1細胞后30 min，在0～200 mGy吸收劑量范圍內53BP1焦點水平（均數±標準差）隨劑量的增加呈上升趨勢，且具有較好的劑量-效應關系。采用一元回歸線性分析擬合曲線如下：y=（0.03×10-2）x+2.32×10-2，（R2=0.9236，P＜0.01）。其中y代表53BP1焦點形成水平，x代表吸收劑量，如圖2所示。

圖2 不同劑量60Co γ射線照射AHH-1細胞53BP1焦點形成水平劑量-效應曲線圖

表1 不同劑量60Coγ射線照射AHH-1細胞培養30 min后53BP1焦點形成分布

3 討論

目前，核能在世界范圍內的醫學領域利用越來越普遍。X射線計算機斷層攝影術在診斷中的應用、核醫學PET/CT應用飛速的發展以及腫瘤放射治療等均可導致醫療照射和職業照射等。這些情況下，除放射治療外，照射多為低劑量輻射，因而尋求高效、快捷簡便而準確的低劑量電離輻射劑量估算方法具有十分重要的價值。

研究發現，細胞受到電離輻射照射后，組蛋白H2AX在磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3kinase，PI3K）家族成員毛細血管共濟失調突變基因（ataxia telangiectasia mutated gene，ATM）、ATM和Rad3相關蛋白（ATM and Rad3 related protein，ATR）及DNA依賴性蛋白激酶（DNA dependent protein kinase，DNA-PK）等的作用下，距離C端較近的絲氨酸139位在1～3 min內發生磷酸化形成γH2AX，并在30 min內都可以保持較高的表達水平［3］。在DNA損傷修復反應早期，組蛋白H2AX的磷酸化（γH2AX）是最早發生的分子事件之一，在數個至數十個毫戈瑞（mGy）照射后即可觀察到γH2AX焦點形成［4-5］。而γH2AX則可以在DNA損傷位點募集53BP1參與DNA損傷修復，表現為經過免疫熒光染色處理后可見發光的焦點，也使得53BP1具有成為低劑量輻射生物標志物的潛力［1，6］。

53BP1也是重要的DNA雙鏈損傷標志物之一，其基因位于染色體15q15-21，有11 kb和6.6 kb兩種轉錄產物，其可參與到DNA損傷修復和調節細胞周期以保護基因組穩定性［7］。Lamkowski等［8］用60Coγ射線照射小豬后發現53BP1焦點形成水平有劑量-效應關系。Horn等［9］將53BP1、γH2AX同淋巴細胞亞群中含半胱氨酸的天門冬氨酸蛋白水解酶激活情況結合共同估算電離輻射受照劑量。這些結果均表明53BP1表達水平有望成為與劑量相關的新型輻射生物標志物。

本研究利用免疫熒光染色技術，通過觀察AHH-1細胞受到低劑量60Coγ射線照射后53PB1的焦點形成水平，試圖初步探討在低劑量電離輻射水平照射，即0～200 mGy之間且吸收劑量率＜20 mGy/min的條件下，53BP1焦點形成水平的劑量-效應關系，以期為尋找低劑量相關輻射生物標志物提供科學依據。研究結果顯示，53BP1在照射后30 min焦點形成在50～200 mGy劑量范圍內呈增加趨勢，且存在較好的劑量-效應關系。50 mGy劑量以下并未見明顯變化，可能是因為53BP1表達過低，也可能是因為隨著DNA損傷的修復53BP1逐漸消失［10］。本研究將照射后細胞修復時間定為30 min，是鑒于53BP1的表達在受照后30 min處于最高水平，30 min后表達水平迅速下降［10］。

4 結語

人淋巴細胞53BP1蛋白焦點形成水平在低水平電離輻射作用下具有較好的劑量-效應關系，其可用作檢測低水平電離輻射所致的DNA雙鏈損傷，53BP1有望成為一種快捷高效的與低劑量相關輻射生物標志物。

［1］Huyen Y，Zgheib O，Ditullio RA Jr，et al. Methylated Iysine 79 of histone H3targets 53BP1 to DNA double-strand breaks［J］.Nature，2004，432（7015）：406-411.

［2］Michal Zimmermann，Titia de Langeemail.53BP1：pro choice in DNA repair［J］.Trends Cell Biol，2014，24（2）：108-117.

［3］An J，Huang YC，Xu QZ，et al.DNA-PKcs plays a dominant role in the regulation of H2AX phosphorylation in response to DNA damage and cell cycle progression［J］.BMC Mol Biol，2010，11：18.

［4］Jeggo PA，L?brich M.Artemis links ATM to double strand break rejoining［J］.Cell Cycle，2005，4（3）：359-362.

［5］Rothkamm K，Balroop S，Shekhdar J，et al. Leukocyte DNA damage after multi-detector row CT：a quantitative biomarker of low-level radiation exposure［J］.Radiology，2007，242（1）：244-251.

［6］Bekker-Jensen S，Lukas C，Melander F，et al. Dynamic assembly and sustained retention of 53BP1 at the sites of DNA damage are controlled by Mdc1/NFBD1［J］.J Cell Biol，2005，170（2）：201-211.

［7］Iwabuchi K，Bartel PL，LiB，et al.Two cellular proteins that bind to wild-type but not mutant p53［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1994，91（13）：6098-6102.

［8］Lamkowski A，Forcheron F，Agay D，et al. DNA damage focus analysis in blood samples of minipigs reveals acute partial body irradiation［J］.PloS One，2014，9（2）：e87458.

［9］Horn S，Barnard S，Brady D，et al.Combined analysis of gamma-H2AX/53BP1 foci and caspase activation in lymphocyte subsets detects recent and more remote radiation exposures［J］. Radiat Res，2013，180（6）：603-609.

［10］Marková E，Schultz N，Belyaev IY.Kinetics and dose-response of residual 53BP1/gamma-H2AX foci：co-localization，relationship with DSB repair and clonogenic survival［J］.Int J Radiat Biol，2007，83（5）：319-329.

Research on dose-response of 53BP1 foci level in human lymphoblastoid cells induced by low dose irradiation

XU Yan， FENG Jiang-bin， LU Xue， et al// China Medical Equipment，2016，13（4）：106-108.

Objective： To investigate the dose- response relationship between the levels of 53BP1 foci in the lymphocyte cells AHH-1 and the absorbed doses of low dose irradiation. Methods：Lymphocyte cells AHH-1 were exposed to different absorbed dose levels of60Co γ-rays （0， 10， 25，50， 100 and 200 mGy at the absorbed dose-rate of 20 mGy/min）. Immunofluorescence analysis was carried out 30 min after irradiation and the formation of 53BP1 foci （foci/per cell） was analyzed using laser scanning confocal fluorescence microscope. Results： Within the dose range of 0-200 mGy， the levels of 53BP1 foci were conformed to the Poisson distribution. The levels of 53BP1 were enhanced when the dose level was above 50 mGy， and the dose-response curve was well fitted as y=（0.03×10-2）x+2.32×10-2（R2=0.9236， P＜0.01）. Conclusion： There is a good dose-response relationship between the levels of 53BP1 foci and the low doses， and hence it could be applicable as a biomarker of low dose radiation.

Low dose irradiation；60Co γ-rays； Immunofluorescence； 53BP1

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2016.04.033

1672-8270（2016）04-0106-03

R144.1

A

2015-05-10

國家自然科學基金（81573081）“人外周血淋巴細胞核質橋作為快速輻射生物劑量計的研究”；國家自然科學基金（81172593）“GDF15和PIG3基因表達變化作為快速輻射生物劑量計的研究”

①中國疾病預防控制中心輻射防護與核安全醫學所 輻射防護與核應急中國CDC重點實驗室 北京 100088

*通訊作者：qjliu@nirp.cn

徐巖，男，（1989- ），碩士研究生。中國疾病預防控制中心輻射防護與核安全醫學所 輻射防護與核應急中國CDC重點實驗室，從事輻射損傷生物標志物研究工作。