異育銀鯽嗜水氣單胞菌的分離鑒定與病理組織學觀察

耿昕穎，王家禎，董文龍，單曉楓，馬紅霞，高云航

（吉林農業大學動物科學技術學院，吉林 長春 130118）

異育銀鯽嗜水氣單胞菌的分離鑒定與病理組織學觀察

耿昕穎，王家禎，董文龍，單曉楓，馬紅霞，高云航

（吉林農業大學動物科學技術學院，吉林 長春 130118）

為鑒定吉林省某養殖場所養殖異育銀鯽（carassius auratus gibelio）死亡原因，在瀕死魚的肝、胰、脾、腎臟分離得到一株優勢菌，經細菌形態、常規理化特性鑒定、人工感染試驗、16S rRNA基因序列測定、病理解剖學及病理組織學觀察，結果表明：分離株為氣單胞菌屬的嗜水氣單胞菌，并將其命名為JL-PW-3。該分離株對環丙沙星、氟苯尼考、強力霉素、氯霉素等高度敏感；對慶大霉素、阿米卡星、阿莫西林、阿奇霉素、紅霉素、恩諾沙星、磺胺間甲氧嘧啶等完全耐藥。

異育銀鯽；嗜水氣單胞菌；分離鑒定；病理學

異育銀鯽是由方正銀鯽為母本，以興國紅鯉為父本，經人工繁育的子代，具有生長快、個體大、抗病性強等特點，是我國著名的淡水魚類之一［1］。幾年來隨著養殖規模的擴大，加之水體環境的惡化，各種病害不斷出現，給我國異育銀鯽的養殖帶來巨大危害，造成了嚴重的經濟損失。

嗜水氣單胞菌在世界各地均有分布，是人獸共患的條件性致病菌［2-4］，并能夠引起多種淡水魚類大量死亡［5-6］，給我國整個水產行業都造成了巨大的損失。2013年吉林省某養殖場的異育銀鯽自然發病并出現大批量死亡，病魚的主要癥狀為眼部突出，嘴角、體表、鰭條基部出血，腹部腫脹，肛門紅腫、外凸，尾鰭出血、潰爛，嚴重病魚體表鱗片脫落。本試驗從具有典型癥狀的鯽魚體內分離出該致病菌，對其菌落形態、生理生化特性鑒定，結合分子生物學16S rRNA核苷酸同源性分析和系統發育構建樹對病原菌進行鑒定，并對其所導致的病理學變化及藥敏性檢測進行研究，以便為鯽魚的病害防治提供科學依據。

1　材料

1.1病料來源及試驗動物吉林省某養殖場養殖的異育銀鯽自然發病并出現大量死亡，體重200～250 g，癥狀表現為鰓和鰭條出血、充血，腹部腫脹，腸道充血并伴有腹水，疑似嗜水氣單胞菌感染。供感染的試驗魚，購自吉林省某養殖場的健康異育銀鯽，體重60～70 g。

1.2培養基、主要試劑及藥品普通瓊脂培養基、細菌微量生化鑒定管，購自杭州天和微生物試劑有限公司；甲醛、無水乙醇、二甲苯、石蠟、蘇木精染液，均購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；慶大霉素、阿米卡星、環丙沙星、強力霉素、阿莫西林、紅霉素、阿奇霉素、恩諾沙星、氟苯尼考、氯霉素、磺胺間甲氧嘧啶，均由海洋醫化生物科技有限公司惠贈。

2　方法

2.1病原菌的分離培養及形態觀察在無菌條件下取典型癥狀的病異育銀鯽，以肝、胰、脾、腎臟為樣本劃線接種于普通瓊脂固體培養基上，30℃培養24 h做細菌分離，待長出菌落后，挑取單個菌落獲取純培養物，制成涂片標本，經革蘭染色后，鏡檢細菌形態。

2.2生理生化反應純化后的細菌經30℃培養后分別接種微量生化反應管，按說明書操作進行。同時進行精氨酸雙水解酶試驗、賴氨酸脫羧酶試驗、鳥氨酸脫羧酶試驗、V-P試驗、M.R.試驗、H2S固體穿刺試驗、氧化酶試驗、吲哚試驗、肌醇試驗，30℃培養24～72 h，觀察并記錄結果。

2.3人工感染試驗

2.3.1人工注射感染試驗采用菌落計數法將已培養的菌液濃度稀釋為5個梯度：4.725×104、4.725× 105、4.725×106、4.725×107、4.725×108CFU/mL。試驗選用暫養1周的健康異育銀鯽，菌液腹腔注射30尾魚，0.15 mL/尾；同時設立同劑量無菌生理鹽水作為試驗對照組。每組試驗魚隔離養于恒溫25℃玻璃缸中，正常飼養管理，連續觀察1周，并記錄其感染發病時間與死亡情況。

2.3.2人工再感染試驗在人工感染患病瀕死的試驗魚中，取臨床癥狀與自然患病瀕死魚癥狀相似的魚肝、脾、腎臟和腸道等組織進行常規再分離，挑取與原人工感染試驗菌落形態特征一致的單菌落，進行人工再感染試驗，觀察魚的活動情況并作好記錄。

2.4病理學觀察對主要病/死異育銀鯽進行臨床和主要病理變化的觀察。采集發病癥狀明顯異育銀鯽的肝、脾、腎、腸道等主要組織，10%甲醛進行固定并對相應的組織進行常規的石蠟切片，常規H.E.染色，在顯微鏡下進行病理組織學觀察。

2.516S rRNA基因序列測定將純化后的菌株接種于普通營養肉湯培養基上30℃培養12 h后，提取細菌DNA。16S rRNA基因PCR擴增引物分別為：TY-1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′、TY-2：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，以細菌DNA為模板，TY-1/TY-2為引物進行PCR擴增，PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。將PCR回收產物與pMD18T-載體連接，轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞，并將陽性克隆送往上海生工生物工程技術服務有限公司測序，測序的結果利用NCBI BLAST軟件進行序列比較分析。

2.6藥物敏感性試驗參照CLSI推薦的微量肉湯稀釋法檢測分離株對慶大霉素、阿米卡星、環丙沙星、強力霉素、阿莫西林、紅霉素、阿奇霉素、恩諾沙星、氟苯尼考、氯霉素、磺胺間甲氧嘧啶的MIC值，以大腸桿菌ATCC?25922作為質控株，將培養物于30℃培養18～24 h觀察結果，結果遵循CLSI的臨界濃度作為判斷標準。

3　結果與分析

3.1細菌的分離及形態特性分離菌株在普通營養瓊脂培養基上經30℃恒溫培養24 h后菌落為圓形，中央隆起，邊緣整齊，半透明呈淺黃色，芳香味，無水溶性色素，生長豐盛（見前插彩版圖1）。在普通肉湯培養基中經30℃恒溫培養24 h后呈均勻渾濁生長，管壁有菌膜，管底有菌體沉淀，搖晃時易碎呈線狀上升并消散。對分離純化單菌落進行革蘭染色，在40倍顯微鏡下觀察，結果為革蘭陰性菌，短桿狀，兩端鈍圓或直平（見前插彩版圖2）。

3.2細菌的生理生化鑒定生理生化鑒定結果顯示，分離株發酵葡萄糖、L-阿拉伯糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、甘露醇等，不發酵鼠李糖、木糖。精氨酸雙水解酶、賴氨酸脫氫酶、鳥氨酸脫氫酶、VP試驗、M.R.試驗、氧化酶、H2S固體穿刺試驗均為陽性，吲哚試驗、肌醇為陰性。

3.3人工注射感染試驗結果

3.3.1人工注射感染對從病魚分離出來的菌株進行人工懸菌液感染試驗，結果不同接菌濃度出現不同程度的死亡，當菌液濃度為4.725×108CFU/mL時，試驗組異育銀鯽在96 h內全部死亡，而對照組在試驗觀察期內則未出現任何死亡現象（表1）。

表1　菌株人工注射感染鯽魚

3.3.2人工注射再感染試驗在試驗瀕死魚的肝、脾、腎、腸道中經常規分離培養可分別得到與病原菌一致的菌株，經再次感染又可分離到與病原菌一致的菌株，說明分離得到的菌株為魚的致病菌。

3.4病理學觀察結果

3.4.1臨床癥狀和剖檢變化癥狀主要表現為病魚口腔、頭部、眼眶、鰓蓋邊緣、鰭條基部及魚尾邊緣充血，腹部腫脹，肛門紅腫，剖檢后發現魚鰓充血、出血，腹腔內有大量淡黃色積液，腸道充血發紅，肝胰臟顏色變淺，脾、腎顏色加深等癥狀。

3.4.2病理組織切片觀察結果與健康魚腸道相比較，感染魚腸絨毛崩解，腸腔內充滿壞死的細胞碎片，腸黏膜上皮細胞變性、壞死脫落，杯狀上皮細胞增多，固有層和黏膜下層毛細血管擴張、淤血，有少量的炎性細胞和血細胞浸潤，腸肌纖維扭曲紊亂，加粗水腫（見前插彩版圖3）。

與健康魚肝臟相比較，病魚肝組織中央靜脈擴張并有大量血細胞，肝細胞腫脹，局部有空泡，肝竇擴張、淤血，其內充滿完全溶解的紅細胞，少量魚肝組織可見局灶性壞死，尚未發現嚴重病變魚含有雙核細胞（見前插彩版圖4）。

與健康魚腎臟相比較，感染魚腎臟失去原有的組織結構，崩潰解體，有大面積的壞死細胞，腎小管上皮細胞腫脹，排序紊亂，嚴重區域腎小球崩解、壞死，血管球腫脹，毛細血管擴張，可見較多被H.E.染色成棕黃色樣色素沉著（見前插彩版圖5）。

與健康魚相比較，感染魚充血，脾髓充滿紅細胞，脾臟組織結構紊亂，崩潰解體，有大量空泡樣結構，細胞核破裂溶解，脾小體結構不清，嚴重區域可見大量被H.E.染色成棕黃色血源性色素沉著（見中插彩版圖6）。

3.516S rRNA基因序列測定及同源性分析PCR擴增出1 450 bp的片段，與預期結果一致（如圖7）。將測序結果與GenBank上已發表的幾株嗜水氣單胞菌的16S rRNA序列進行同源性分析，該菌與GenBank所發表的嗜水氣單胞菌的16S rRNA同源性最高，達到了99%。

圖7　分離菌株J L-PW-3的PCR擴增

3.6藥物敏感性試驗在本試驗中采用微量肉湯稀釋法來測定分離株的藥物敏感性，結果如表2所示。

4　討論

圖8　菌株J L-PW-3 16S rRNA基因序列發育樹

表2　11種抗菌藥物對分離株的MIC

嗜水氣單胞菌對淡水魚具有強致病性，祖國掌等報道了安徽省草魚細菌性敗血癥的主要致病菌為嗜水氣單胞菌，造成了魚類大量死亡［7］。王友娟等［8］在遼寧地區發現51株嗜水氣單胞菌引起淡水魚致病死亡，其中有24株以全身出血為主要癥狀，17株可引起魚體表潰爛，腹部腫脹，由此可見，不同地區嗜水氣單胞菌均會給水產養殖業造成不同程度的危害。本研究通過病理組織學觀察可發現，病死魚主要病理變化為全身各細胞腫脹，壞死脫落，特別是肝，脾，腎，腸道病變較為嚴重，導致體內鈉、鉀代謝平衡失調，所以腹水嚴重，管腔變窄，導致血流發生障礙，致使循環血量降低，血流量減少，大量紅細胞侵潤，周圍淋巴細胞減少造成了魚體自身免疫力下降，加速了試驗魚的死亡，腸肌纖維紊亂、扭曲成空泡樣結構，嚴重影響了腸道消化吸收功能，從而導致異育銀鯽攝食量減少。本試驗已證實造成異育銀鯽死亡的致病菌為嗜水氣單胞菌，其預防及防治措施還有待進一步研究和探索。

Vivekanandhan等［9］利用15種抗生素對315株嗜水氣單胞菌進行藥物敏感性試驗，結果表明，對多粘霉素B，萬古霉素，利福平等7種抗菌藥物產生了高度耐藥性，且出現不同程度的多重耐藥。目前我國水產疫苗相對較少，抗菌藥物仍是治療嗜水氣單胞菌的主要方法，但藥物使用過多、濫用，導致抗藥性的菌株不斷增多。本試驗采用了11種抗生素對分離的致病株JL-PW-3進行藥敏試驗，結果該菌對8種抗生素等具有耐藥性，從耐藥性結果來看，該菌的耐藥性不容樂觀，可能與耐藥性的直接和間接傳播有關，后續可對其耐藥機制進一步的研究。洪經等［10］對國內不同地區40株嗜水氣單胞菌進行耐藥機制的研究發現，嗜水氣單胞菌耐藥情況嚴重，且多重耐藥普遍抗菌藥物的過多使用會導致魚類致病菌出現更多的耐藥情況，導致想要獲得良好的治療效果需結合有效的藥敏試驗科學、合理的用藥。

［1］沈懷舜，楊官品，許璞.異育銀鯽準回交世代經濟性狀優勢的遺傳基礎研究［J］.中國海洋大學學報，2005，35（2）：219-214.

［2］Khushiranabi R，Girisha S K，Bhowmick P P.Prevalence of different outer membra-ne proteins in isolates of Aeromonas species［J］.Word Journal of Microbiology and Biotechnology，2008，24：2263-2268.

［3］李鵬，陶茂暉，李曉云，等.雛雞嗜水氣單胞菌感染的診斷［J］.畜牧與獸醫，2005，37（6）：36-37.

［4］劉堂水，汪成竹，陳昌福.斑點叉尾鮰細菌性病原的分離與鑒定［J］.華中農業大學學報，2006，25（5）：550-554.

［5］周飛，劉娟，黎德兵.黃鱔嗜水氣單胞菌的分離鑒定及中藥體外抑菌效果研究［J］.中國畜牧獸醫，2010，37（2）：135-137.

［6］孟彥，肖漢兵，張林，等.施氏鱘出血性敗血癥病原菌的分離和鑒定［J］.華中農業大學學報，2007，26（6）：822-826.

［7］祖國掌，余為一，李槿年.草魚細菌性敗血癥的診斷及流行病學調查［J］.淡水漁業，2000，30（5）：35-37.

［8］王友娟，李榮峰，李華，等.遼寧地區養殖淡水魚感染嗜水氣單胞菌的流行病學調查［J］.中國農業科技導報，2012，14（4）：128-134.

［9］Vivekanandhan G，Savithamani K，Hatha AAM，et al.Antibiotic resistance of Aeromorras hydrophila isolated form marketed fish and prawn of South India［J］.Food Microbiol，2002，76（1/2）：165-168.

［10］洪經，潘連德.魚源嗜水氣單胞菌質粒的指紋圖譜及其與耐藥性的關系［J］.水產學報，2010，34（12）：1908-1915.

Isolation and Identification ofAeromonas hydrophliaand histopathological examination

GENG Xin-ying，WANG Jia-zhen，DONG Wen-long，SHAN Xiao-feng，MA Hong-xia，GAO Yun-hang
（College of Animal Science and Technology，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China）

In order to identify the cause of death of carassius auratus gibelio in farms in Jilin Province，a dominant bacterium was isolated from liver，hepatopancreas，spleen and kidney in dying fish.All the results of morphological observation，physical and biochemical identification assays，artificial infection test，determination of 16S rRNA gene sequences and pathological and histological observation conformed that this bacterium was Aeromonas hydrophlia，named as JL-PW-1.This isolate was highly sensitive to ciprofloxacin，florfenicol，doxycycline，and chloramphenicol，but completely resistant to gentamicin，amikacin，amoxicillin，azithromycin，erythromycin，enrof-loxacin，sulfamono methoxine and other drugs.

carassius auratus gibelio；Aeromonas hydrophlia；isolated identification；pathology

GAO Yun-hang

S943

A

0529-6005（2016）04-0109-03

2015-03-25

國家自然科學基金項目（31201927）；吉林省重點科技攻關項目（20150204065NY）

耿昕穎（1993-），女，碩士生，研究方向為動物疫病防治，E-mail：1160455285@qq.com

高云航，E-mail：gaoyunhang@163.com