豬源產腸毒素大腸桿菌三重PCR檢測方法的建立及應用

陶　政，曾文斌，劉悅欣，左明開，幸文定，白帥州，張學良，王　萍

（1.江西農業大學動物科學技術學院，江西 南昌 330045；2.南昌市動物疫病預防控制中心，江西 南昌 330008）

豬源產腸毒素大腸桿菌三重PCR檢測方法的建立及應用

陶政1，曾文斌1，劉悅欣1，左明開1，幸文定1，白帥州1，張學良2，王萍1

（1.江西農業大學動物科學技術學院，江西 南昌 330045；2.南昌市動物疫病預防控制中心，江西 南昌 330008）

為建立一種簡單、快速、靈敏、準確的產腸毒素大腸桿菌（ETEC）檢測方法，根據產腸毒素大腸桿菌菌毛（K88）和毒素（STa和LT）基因分別設計合成了1對引物，對K88、STa和LT基因擴增條件進行優化，建立了檢測K88、STa和LT的三重PCR方法。該方法對K88、STa和LT基因的擴增產物分別為499 bp，190 bp和373 bp；此外，該方法具有良好的靈敏性和特異性。本實驗建立的三重PCR方法為致幼畜腹瀉ETEC的檢測提供了快速準確方法。用所建立的三重PCR方法對實驗室從臨床腹瀉樣品中分離的120株大腸桿菌進行檢測，結果9株為K88/LT/STa陽性，14株為K88/LT陽性，21株K88/STa陽性，13株LT/STa陽性，8株K88陽性，2株LT陽性，12株STa陽性。

產腸毒素大腸桿菌；三重PCR；K88菌毛；STa毒素；LT毒素

能夠引起仔豬產生腹瀉的最常見的病原型大腸桿菌有產腸毒素（enterotoxigenic，ETEC）、腸出血性（enterohaemorrhagic，EHEC）、腸致病性（enteropathogenic，EPEC）、腸侵襲性（enteroinvasive EIEC）和產志賀菌毒素（shiga toxin producing STEC）大腸埃希菌。其中，ETEC是最常見一種致病性大腸埃希菌，能夠引起仔豬急性水樣腹瀉和迅速脫水死亡，死亡率和發病率均很高，這給養殖業帶來了嚴重的經濟損失。

產腸毒素大腸桿菌性腹瀉主要發生于集約化的養豬場和種豬場，常引起0～6日齡新生仔豬和3～6周齡斷奶仔豬的腹瀉。ETEC主要包括腸毒素和粘附素兩種毒力因子。粘附素也稱為菌毛，主要有K88、K99、987P、F17、F18和F41［1］，其中K88是引起我國仔豬腹瀉的主要ETEC菌毛。相比于種類繁多的菌毛，腸毒素只有熱敏腸毒素（LT）和耐熱腸毒素（ST）兩個主要類型，二者均由質粒編碼［2］，其中ST包含STa與STb兩種［3］。ETEC菌株可單獨產生ST或LT，或兩種毒素同時產生［4］。

目前檢測大腸桿菌毒素的方法主要有動物試驗、凝集試驗、瓊指擴散試驗，這些方法不僅費時費力，而且具有一定的局限性［5-6］。隨著分子生物學技術的不斷發展，PCR技術具有特異、敏感、快速等優點［7］。本試驗設計了3種大腸桿菌毒素基因特異引物，建立檢測ETEC的K88、STa和LT基因三重PCR檢測方法，為ETEC的檢測及鑒定提供了有效的方法。

1　材料與方法

1.1菌株C83902（K88+、LT+和STa+），購自中國獸醫藥品監察所；沙門菌、豬丹毒桿菌、多殺性巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌、鏈球菌和鴨疫里默菌和臨床分離的120株E.coli分離株，均由江西農業大學預防獸醫細菌研究室保存。

1.2主要試劑及培養基Taq DNA Polymerase、dNTPs、Trans2K DNA Marker，均購自北京全式金生物技術有限公司；麥康凱瓊脂培養基和普通營養瓊脂培養基由本實驗室配制。

1.3引物設計與合成根據GenBank登錄中的序列（登錄號：M25302、M58746和AB011677），針對ETEC的3種毒力基因（K88、STa和LT）設計了3對特異性引物，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成（表1）。

表1　ETEC毒力基因多重PCR引物

1.4DNA模板的制備按文獻［5］的方法，采用煮沸方法提取細菌DNA。

1.5PCR反應條件的優化PCR擴增體系為25 μL，所用模板DNA 2.5 μL。試驗以含K88、STa和LT基因的C83902菌株作為模板，分別對影響PCR擴增的dNTPs濃度、引物濃度、退火溫度等因素進行優化。在確定了dNTPs和退火溫度后，優化引物濃度。

1.6三重PCR的敏感性試驗將標準菌株C83902于37℃振蕩（140 r/min）15 h，取培養菌液倍比稀釋為101CFU/mL到105CFU/mL，各濃度稀釋液分別作為PCR模板，進行三重PCR擴增，測定反應的靈敏性。

1.7三重PCR擴增的特異性分別對標準菌株C83902、豬丹毒桿菌、沙門菌、多殺性巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌、鏈球菌株和鴨疫里默菌株進行檢測，以確定三重PCR方法的特異性。

1.8對E.coli分離菌株的檢測采用建立的多重PCR方法對實驗室從仔豬臨床腹瀉樣品中分離的120株E.coli分離菌進行PCR檢測鑒定，并對結果進行分析。

2　結果與分析

2.1三重PCR擴增條件的檢測和優化結果三重PCR方法對K88、STa和LT 3種基因的擴增產物分別為499 bp，190 bp和373 bp；通過對影響PCR擴增的dNTP濃度、引物濃度以及退火溫度等因素進行優化。該多重PCR擴增體系最終確定為：dNTPs（0.4 mmol/L）3 μL，10×PCR Buffer 7 μL，Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.8 μL，雙蒸水10 μL，模板DNA 2.5 μL，K88、LT和STa的上下游引物（20 μmol/L）分別為0.25 μL、0.25 μL和0.35 μL。反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性50 s、53℃退火30 s、72℃延伸60 s，33個循環；72℃延伸10 min（圖1）。

圖1　不同溫度下ETEC的多重PCR擴增結果

2.2三重PCR擴增的靈敏性對標準菌株模板10倍倍比稀釋，利用優化好的多重PCR擴增條件進行PCR靈敏性檢測，結果顯示，C83902標準菌株三重PCR反應的最低靈敏度為103CFU/mL（圖2）。

2.3三重PCR擴增的特異性利用優化好的多重PCR擴增條件，將對照菌株和標準菌株進行PCR檢測，結果顯示，標準菌株C83902擴增出了K88、STa和LT三個基因片段，而其他菌株則沒有出現任何條帶（圖3）。

2.4對E.coli分離菌株的多重PCR檢測采用多重PCR方法對實驗室分離的120株E.coli進行檢測，結果檢出ETEC陽性79份，即ETEC的檢出率為65.8%，其中K88/LT為17.7%（14/79），K88/STa為26.6%（21/79），LT/STa為16.5%（13/79），K88+LT+STa為11.4%（9/79），L T為48.1%（38/79），STa為69.6%（55/79），K88+為65.8%（52/79）。表明產腸毒素大腸桿菌江西分離株的主要毒力基因型是STa和K88的毒力表型。

圖2　多重PCR擴增敏感性實驗

圖3　多重PCR擴增特異性實驗

3　討論

引起仔豬出現腹瀉性癥狀的病原有很多種，而ETEC感染只是其中的一種病原，所以要仔豬腹瀉是否是由產腸毒素大腸桿菌感染導致，僅從病理解剖和臨床癥狀只能做出初步診斷，而必須依賴于病原學的檢測，并對產腸毒素大腸桿菌的分子流行病學進行調查研究。

多重PCR技術能夠在同等的時間內對多條靶基因進行擴增，相比常規的PCR而言，不僅更高效，而且能夠在分子水平上適應大批量樣品的快速檢測［8-9］，為仔豬等動物細菌性腹瀉提供了有效快捷的研究手段。本試驗所建立的產腸毒素大腸桿菌三重PCR檢測方法中，對產腸毒素大腸桿菌的粘附素K88、腸毒素LT和STa，大小分別為499 bp、373 bp和190 bp的基因片段進行擴增，即可在一次PCR中方便的檢測出這3種毒力基因。通過對三重PCR反應的dNTP濃度、反應敏感性、特異性和退火溫度等條件進行優化，最終確定dNTP終濃度為0.4 mmol/L，K88、LT和STa引物終濃度均為20 μmol/L，引物的最佳退火溫度為53℃，三重PCR的敏感性檢測最低可達103CFU/mL，所建立的多重PCR具有高度的特異性。

對江西臨床上發病的120份仔豬腹瀉病料進行檢測，通過建立的多重PCR檢測方法進行擴增，得到了79份陽性的產腸毒素大腸桿菌，即ETEC的檢出率為65.8%，其主要表型毒力基因型是STa和K88，分別占到了69.6%（55/79）和65.8%（52/79），表明產腸毒素大腸桿菌引起的仔豬腹瀉比較嚴重。建立多重PCR檢測方法可以從基因水平檢測ETEC，

通過對樣品增菌后即用于PCR檢測，不但可以快速鑒定是否存在ETEC感染，而且具有檢出率高的優點，更適合于臨床大批樣品的檢測，對仔豬等動物細菌性腹瀉的快速臨床診斷具有一定的臨床意義，也為ETEC引起的其他類似流行性疾病提供了有效快捷的研究手段。

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［2］Johnson T J，Nolan L K.Pathogenomics of the virulence plasmids of Escherichia coli［J］.Microbiol Mol Biol Rev，2009，73（4）：750-774.

［3］Nataro J P，Kaper J B.Diarrheagenic Escherichia coli［J］.Clin Microbiol Rev，1998，11（1）：142-201.

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［5］華榮虹，張書霞，何孔旺.豬源腸毒素性大腸桿菌菌毛基因多重PCR檢測方法的建立［J］.中國獸醫學報，2006（02）：162-164.

［6］曾群輝，陳明勇，張冰，等.牦牛大腸埃希氏菌的腸毒素試驗［J］.中國預防獸醫學報，2001（04）：47-48.

［7］聞曉波，崔玉東，朱戰波，等.牛產腸毒素大腸桿菌毒力因子多重PCR檢測方法的建立［J］.中國獸醫學報，2007（03）：322-324.

［8］關怡，黃天培，潘潔茹.應用多元PCR鑒定水體中大腸桿菌的毒素基因［J］.中國農學通報，2010（16）：40-43.

［9］曲澤慧，陳佩佩，張愛芹，等.產腸毒素大腸桿菌多重PCR檢測方法的建立［J］.中國預防獸醫學報，2012（12）：980-982.

Development and Application of triplex PCR Detection of porcineEnterotoxigenic E.coli

TAO Zheng1，ZENG Wen-bin1，LIU Yue-xin1，ZUO Ming-kai1，XING Wen-ding1，BAI Shuai-zhou1，ZHANG Xue-liang2，WANG Ping1
（1.College of Animal Science and Technology，Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045，China；2.NanChang Center for Diseases Prevention and Centrol，Nanchang 330008，China）

To establish a simple，sensitive，accurate and rapid method for the detection of Enterotoxigenic E.coli（ETEC）in pigs，a triplex PCR method was developed based on 3 pairs of primers for the fimbriae genes（K88）and 2 toxin genes（STa，LT）amplification.The reference E.coli strains which passed the different virulence genes were detected.The results showed that 499 bp，190 bp and 373 bp DNA fragments of K88，STa and LT genes were amplified by this protocol，respectively.The triplex PCR was proved to be specific and sensitive.Furthermore，a total of 120 E.coli were tested and theresults showed that 9 samples were K88/ LT/STa positive，14 sample was K88/LT positive，21 sample was K88/LT positive，13 sample was K88/STa positive，8 sample was K88 positive，2 sample was LT and 12 sample was STa positive.The triplex PCR assay provides a method to detect ETEC which causes diarrhea in piglets.

Enterotoxigenic Escherichia coli；Triplex PCR；K88 fimbriae；STa toxin；LT toxin

WANG Ping

S852.61

A

0529-6005（2016）04-0102-03

2015-01-29

江西省科技廳基金項目（20142BBF 60004）

陶政（1991-），男，碩士生，研究方向為動物免疫學基礎理論與運用，E-mail：1552372174@qq.com

王萍，E-mail：jxjs6263wplm@163.com