美洲雁中鴨疫里默菌的分離鑒定及耐藥性分析

陳　卓，羅　靜，蘇　文，張國鋼，何宏軒

（1.中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所 全國鳥類環(huán)志中心 國家林業(yè)局森林保護(hù)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京海淀 100091；2.中國科學(xué)院動(dòng)物研究所 動(dòng)物生態(tài)與保護(hù)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 野生動(dòng)物疫病研究中心，北京 朝陽 100101）

美洲雁中鴨疫里默菌的分離鑒定及耐藥性分析

陳卓1，羅靜2，蘇文2，張國鋼1，何宏軒2

（1.中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所 全國鳥類環(huán)志中心 國家林業(yè)局森林保護(hù)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京海淀 100091；2.中國科學(xué)院動(dòng)物研究所 動(dòng)物生態(tài)與保護(hù)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 野生動(dòng)物疫病研究中心，北京 朝陽 100101）

從北京密云某美洲雁養(yǎng)殖場的發(fā)病美洲雁的肝臟中分離病原菌，并對(duì)病原菌進(jìn)行染色鏡檢、生化檢測(cè)及PCR檢測(cè)，鑒定出1株鴨疫里默菌，對(duì)其進(jìn)行耐藥性分析，結(jié)果顯示，該菌株對(duì)阿莫西林/克拉維酸、頭孢噻吩、頭孢噻肟、頭孢唑啉、慶大霉素、氨芐西林高敏；對(duì)氯霉素、環(huán)丙沙星和阿米卡星中敏；對(duì)卡那霉素、四環(huán)素和復(fù)方新諾明耐藥。

美洲雁；鴨疫里默菌病；分離鑒定；耐藥性

鴨疫里默菌（Riemerella anatipestifer，RA）病，是感染鴨、鵝、火雞等多種禽類的一種接觸性傳染病，又稱鴨傳染性漿膜炎（Infectious serositis）、新鴨病（New duck syndrome）或鴨敗血癥（Duck septicemia），由鴨疫里默菌引起［1］。目前已從家鴨、鵝、火雞以及野鳥中分離到鴨疫里默菌［1-3］。該病的臨床癥狀主要有流鼻液、呼吸困難、鼻竇腫脹、神經(jīng)紊亂和腹瀉等，并引起雛鴨肝周炎、纖維心包炎、關(guān)節(jié)炎和氣囊炎，有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)無臨床癥狀的呼吸道感染［1，4-5］。由于其高發(fā)病率和死亡率，是目前危害養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)最為嚴(yán)重的細(xì)菌性傳染病之一。外膜蛋白A（ompA）基因，是RA的保守基因，其編碼蛋白可誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)，對(duì)細(xì)菌的粘附性和致病性起重要作用［6-7］。本試驗(yàn)對(duì)北京密云某美洲雁養(yǎng)殖場中的病死美洲雁進(jìn)行了細(xì)菌檢測(cè)，分離鑒定出鴨疫里默菌，并進(jìn)行耐藥性分析，對(duì)鴨疫里默菌病的防制提供依據(jù)。

1　材料

1.1主要材料北京密云某美洲雁養(yǎng)殖場的發(fā)病美洲雁；對(duì)照所用大腸桿菌和鴨疫里默菌均為實(shí)驗(yàn)室以往所分離到的菌株。

1.2主要試劑巧克力瓊脂培養(yǎng)基，含5%犢牛血清的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，MH培養(yǎng)基，生理生化鑒定試劑，均購自北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司；藥敏紙片，購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司；2×Taq PCR Master Mix、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；DNA Marker DL-2 000，購自寶生物工程（大連）有限公司；引物由北京華大基因合成。

2　方法

2.1細(xì)菌分離培養(yǎng)無菌條件下，采集病死美洲雁肝臟組織，接種于巧克力瓊脂培養(yǎng)基上，放入?yún)捬豕拗?7℃培養(yǎng)24～48 h，觀察細(xì)菌生長狀況，挑取單菌落在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中進(jìn)行增菌培養(yǎng)并保種。

2.2染色鏡檢挑取單菌落，進(jìn)行革蘭染色，并鏡檢觀察。

2.3生化試驗(yàn)挑取純培養(yǎng)的單菌落到生理鹽水管中，調(diào)節(jié)麥?zhǔn)隙?.5～0.7，吸0.5 mL菌液接種于生化鑒定管中，37℃培養(yǎng)24～48 h后判定結(jié)果。判定標(biāo)準(zhǔn)參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（第九版），及《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》建立的鑒定技術(shù)體系進(jìn)行鑒定。

2.416S rDNA擴(kuò)增參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，提取大腸桿菌、鴨疫里默菌參照株和分離菌株的DNA作為模板。利用16S rDNA基因的通用引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′進(jìn)行擴(kuò)增細(xì)菌d的16S rDNA。擴(kuò)增體系為50 μL：2×Taq PCR Master Mix 25 μL；ddH2O 21 μL；上下游引物各1 μL；DNA模板2 μL；共50 μL。程序：94℃30 s；94℃20 s，55℃45 s，72℃90 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。后送往北京華大基因進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在Gen Bank（http：// www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）中比對(duì)鑒定。

2.5ompA基因擴(kuò)增根據(jù)GenBank中鴨疫里默菌的ompA基因序列設(shè)計(jì)合成下列引物：5′-CACTTTTCTGTCTTTCATTC-3′，5′-CAACTATTTGAGACACGACT-3′。以大腸桿菌、鴨疫里默菌參照株和分離菌株的DNA作為模板進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為：2× Taq PCR Master Mix 25 μL；ddH2O 20 μL；上下游引物各1 μL；DNA模板3 μL；共50 μL。程序：95℃30 s；95℃20 s，53.5℃30 s，72℃60 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2.6藥敏試驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散法，分別用滅菌棉拭子蘸取麥?zhǔn)隙葹?.5～0.7的菌液，均勻涂布MH平板，后分別貼上選擇的藥敏紙片，每塊平板5片，35℃培養(yǎng)18～24 h判定結(jié)果，判定標(biāo)準(zhǔn)參照美國試驗(yàn)時(shí)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（NCCLS）。

3　結(jié)果

3.1病原菌形態(tài)、染色和鏡檢分離到的疑似菌落在巧克力瓊脂培養(yǎng)基上，為半透明、濕潤、光滑、露滴狀、直徑為0.5～1 mm的菌落。革蘭染色鏡檢，為革蘭陰性菌，單個(gè)存在。

3.2生化鑒定結(jié)果生化鑒定表明，分離出的疑似細(xì)菌不分解乳糖、棉子糖、阿拉伯糖、果糖、蔗糖和葡萄糖；不能利用阿拉伯醇、甘露糖、肌醇、酒石酸鹽、醋酸鹽、膽汁肉湯、乙酰胺肉湯；明膠液化試驗(yàn)為陽性；硝酸鹽還原試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)均為陰性；不產(chǎn)生H2S（見表1）。參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（第九版），對(duì)比生化鑒定結(jié)果，同時(shí)結(jié)合菌體以及菌落形態(tài)，初步鑒定分離病原菌為鴨疫里默菌。

表1　細(xì)菌生化鑒定結(jié)果

3.316S rDNA擴(kuò)增結(jié)果擴(kuò)增結(jié)果如圖1，大腸桿菌、RA對(duì)照株和試驗(yàn)分離株均擴(kuò)增出1 400 bp左右的條帶，擴(kuò)增的目的片段序列在NCBI上經(jīng)Blast進(jìn)行序列同源性分析，顯示其與已報(bào)道的鴨疫里默菌同源性為99%（序列號(hào)為KM893400.1，JX195682.1，CP003388.1）。

圖1　PCR擴(kuò)增16SrDNA基因

3.4ompA基因擴(kuò)增結(jié)果ompA基因擴(kuò)增結(jié)果見圖2，RA對(duì)照株和試驗(yàn)分離株均擴(kuò)增出大小為958 bp的條帶，與預(yù)期大小一致。而大腸桿菌和陰性對(duì)照沒有擴(kuò)增出特異性條帶。

圖2PCR擴(kuò)增ompA基因

3.5藥敏結(jié)果藥敏試驗(yàn)結(jié)果（見表2），分離的RA對(duì)卡那霉素、四環(huán)素和復(fù)方新諾明耐藥；對(duì)阿莫西林/克拉維酸、頭孢噻吩、頭孢噻肟、頭孢唑啉、慶大霉素、氨芐西林高敏；對(duì)氯霉素、環(huán)丙沙星和阿米卡星中敏。

表2　分離菌對(duì)抗生素的敏感性結(jié)果

4　討論

鴨疫里默菌是危害鴨類養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的重要病原之一，本試驗(yàn)從病死美洲雁中分離純化細(xì)菌，通過傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)觀察及生化分析，快速縮小病原范圍，初步鑒定出鴨疫里默菌。之后通過對(duì)疑似鴨疫里默菌進(jìn)行16S rDNA測(cè)序，顯示其與鴨疫里默菌的同源性為100%。最后利用鴨疫里默菌的保守基因ompA對(duì)分離菌做進(jìn)一步驗(yàn)證，確定分離到的菌株為鴨疫里默菌，此方法快速準(zhǔn)確，操作簡單，能夠及時(shí)準(zhǔn)確鑒定出鴨疫里默菌，從而減少對(duì)養(yǎng)殖業(yè)帶來的損失。

在本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)分離的鴨疫里默菌進(jìn)行抗生素耐藥性分析，結(jié)果顯示分離出的鴨疫里默菌對(duì)阿莫西林/克拉維酸、頭孢噻吩、頭孢噻肟、頭孢唑啉、慶大霉素、氨芐西林高敏；對(duì)氯霉素、環(huán)丙沙星和阿米卡星中敏；對(duì)卡那霉素、四環(huán)素和復(fù)方新諾明耐藥。以往湖南分離的菌株對(duì)恩諾沙星、氧氟沙星、土霉素、氯霉素、慶大霉素和多粘菌素均敏感［8］；江蘇分離到的菌株對(duì)氟苯尼考、環(huán)丙沙星高敏；對(duì)強(qiáng)力霉素、新霉素中敏；對(duì)磺胺間甲氧嘧啶、土霉素、羅紅霉素低敏［9］；重慶西部分離到的菌株對(duì)頭孢類藥物、氨基糖苷類及黏桿菌素高敏；對(duì)四環(huán)素類、喹諾酮類、青霉素耐藥［10］；韓國分離到的菌株對(duì)卡那霉素、慶大霉素、丁胺卡那霉素、新霉素河鏈霉素比較敏感［11］。可見不同地區(qū)分離的菌株對(duì)各種抗生素的敏感性不同，在用抗生素之前，應(yīng)先進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，根據(jù)結(jié)果選擇敏感的藥物。然而，用藥物預(yù)防治療疾病會(huì)使病菌產(chǎn)生耐藥性，所以對(duì)美洲雁進(jìn)行免疫接種，并加強(qiáng)養(yǎng)殖場的衛(wèi)生消毒和疫病防護(hù)工作，是高效控制疾病的重要手段［12］。

［1］Sandhu.Riemerella anatipestifer infection［M］.Diseases of poultry，Blackwell Publishing Ltd，Oxford，UK，2008：758-764.

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［13］呂敏娜，張毓金，黃承鋒.鴨疫里默菌病的研究進(jìn)展［J］.廣東畜牧獸醫(yī)科技，2001，26：13-15.

Isolation，Identification and Antibiotic ResistanceStudy of Riemerela anatipestiferfrom American Wild Goose

CHEN Zhuo1，LUO Jing2，SU Wen2，ZHANG Guo-gang1，HE Hong-xuan2
（1.Key Laboratory of Forest Protection of State Forestry Administration，National Bird Banding Center of China，The Research Institute of Forest Ecology，Environment and Protection，The Chinese Academy of Forestry，Beijing 100091，China；2.National Research Center for Wildlife Born Diseases，Key Laboratory of Animal Ecology and Conservation Biology，Institute of Zoology，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100101，China）

A pathogenic strain was isolated from the dead American Wild Goose in a farm in Beijing Miyun.According to the colonial morphology，gram strain，biochemical properties and PCR tests，the pathogen was identified as Riemerela anatipestifer.The results of drug resistance tests showed that the bacterium was highly sensitive to amoxicillin/clavulanic acid，cephalothin，cefotaxime，cefazolin，gentamicin，and ampicillin，moderatly sensitive to chloramphenicol，ciprofloxacin and amikacin，and resistant to kanamycin，tetracycline and trimethoprim/sulfamethoxazole.These results provide a theoretical basis for the rapid identification and the therapy of duck infectious serositis.

American Wild Goose；Riemerela anatipestifer；Isolation and identification；Drug resistance

s：HE Hong-xuan；ZHANG Guo-gang

S852.61+8

A

0529-6005（2016）04-0099-03

2015-09-09

林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201404404）；國家林業(yè)局野生動(dòng)物疫源疫病項(xiàng)目專項(xiàng)；中國科學(xué)院戰(zhàn)略生物資源科技支撐體系運(yùn)行專項(xiàng)（CZBZX-1）；“十二五”國家科技支撐計(jì)劃：野生動(dòng)物跨境傳播重要疫病監(jiān)測(cè)與防控技術(shù)研究（2013BAD12B04）

陳卓（1991-），女，碩士生，研究方向?yàn)橐吧鷦?dòng)植物保護(hù)與利用，E-mail：1053526368@qq.com

何宏軒，E-mail：hehx@ioz.ac.cn；張國鋼，E-mail：zm7672@caf.ac.cn