馬齒莧不同提取物對腸炎沙門菌的體外抑菌試驗

周孝瓊，王　華，陳慧芳，王喜娣，劉　嫻，鐘雪香，張秋詩

（1.龍巖學院生命科學學院，福建 龍巖 364012；2.福建省預防醫學與獸醫生物技術重點實驗室，福建 龍巖 364012）

馬齒莧不同提取物對腸炎沙門菌的體外抑菌試驗

周孝瓊1，2，王華1，2，陳慧芳1，王喜娣1，劉嫻1，鐘雪香1，張秋詩1

（1.龍巖學院生命科學學院，福建 龍巖 364012；2.福建省預防醫學與獸醫生物技術重點實驗室，福建 龍巖 364012）

采用牛津杯法和平板法觀察馬齒莧水提物、醇提物和水煮醇提物對腸炎沙門菌的抑制作用。結果表明，馬齒莧水提物和醇提物濃度為1 g/mL時，腸炎沙門菌對其表現為極敏；對水煮醇提物表現為高敏。提取物濃度為0.5 g/ mL時，腸炎沙門菌對水提物表現為極敏；對醇提物和水煮醇提物表現為高敏。濃度為0.25 g/mL時，腸炎沙門菌對馬齒莧水提物和醇提物表現為高敏；對水煮醇提物表現為中敏。3種提取物對腸炎沙門菌的MIC和MBC分別為0.025、0.025 g/mL和0.050 g/mL

馬齒莧；提取物；腸炎沙門菌；體外抑菌

馬齒莧又名長壽菜，是一種長在田間地頭的常見野菜。一般莖為紅褐色，葉片綠色、對生、肥厚，為長倒卵形，全草均可入藥，分布在全世界溫熱帶地區。馬齒莧作為我國傳統中藥在民間已有數千年的應用歷史，我國歷代本草醫書對馬齒莧都有記載。其還是我國衛生部劃定78種藥食同源的野生植物之一［1］，它含有多種對人體有益的營養成分和藥用成分，具有很高的營養價值和藥用價值?，F代藥理研究表明有抑菌、降血糖、降血脂、抗氧化、抗腫瘤、增強免疫力等多種功用［2］。腸炎沙門菌屬于無宿主特異性而有侵害性的病原菌之一，宿主包括人和各種動物。該菌主要引起畜禽的胃腸炎和人類腸炎和食物中毒。近年來，腸炎沙門菌已成為引起胃腸炎和食物中毒的主要病原菌之一。隨著由沙門菌引起的病例不斷上升，該菌不但嚴重阻礙了養禽業的發展，而且還威脅著人畜健康，已成為公共衛生所關注的問題。本試驗研究了馬齒莧3種不同工藝制得的提取物對腸炎沙門菌的抑菌試驗，取得理想效果，為馬齒莧的開發利用提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料中藥馬齒莧，采自福建省龍巖市東肖鎮田野，經本校植物學教授鑒定為馬齒莧科一年生草本植物。秋季全草采收，水洗，切碎于50℃烘箱中烘干備用。菌種：腸炎沙門菌，ATCC13076，購自上海瑞楚生物科技有限公司。LB培養基，購自杭州天和微生物試劑有限公司。

超聲波細胞粉碎機，SCIENTZ-ⅡD，寧波新芝生物科技股份有限公司；旋轉蒸發儀，N-1100，上海愛朗儀器有限公司制造；一體式超純水系統，labtower15EDI，美國熱電；大容量高速冷凍離心機，ST 16R，美國熱電；電子滅菌試驗裝置，HVE-50，日本Hirayama；電子分析天平，AL104-1C，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2方法

1.2.1水提物的制備將馬齒莧10 g分別用10、8、6倍量超純水浸泡蒸餾煮提3次，去渣，合并3次濾液，經旋轉蒸發儀濃縮至10 mL，即得1 g/mL的藥液，經高壓滅菌備用［3］。

1.2.2醇提物的制備將馬齒莧用粉碎機粉碎，過40目篩備用。稱取10 g，加入10倍量70%乙醇，加蓋浸泡30 min。用超聲波細胞粉碎機于50℃，超聲功率20%，超聲工作2 s間歇3 s，總時間為10 min。然后于65℃恒溫水浴浸提2 h，抽濾并保留濾液，濾渣再用等量70%乙醇于65℃恒溫水浴浸提2 h，抽濾。合并兩次濾液，經離心機4 000 r/min離心10 min，分離棄沉淀物制得樣品原液。進一步經旋轉蒸發儀在真空度為0.09 Mpa 60℃下真空濃縮至10 mL，即得1 g/mL的濃縮液［4-8］，經高壓滅菌備用。

1.2.3水煮醇提物的制備將馬齒莧10 g分別用10、8、6倍量超純水浸泡蒸餾煮提3次，第一次回收蒸餾液，去渣，合并3次濾液，4層紗布過濾，經旋轉蒸發儀濃縮至10 mL。加入無水乙醇，使乙醇濃度達75%，調節pH值于6.8-7.2，冰箱冷藏浸提48 h后，濾紙過濾去除沉淀物質，旋轉蒸發儀回收乙醇，冷卻后再次加入無水乙醇，使其濃度達85%，重復以上操作，回收乙醇，最后加入1 mL蒸餾成分，和0.5 mL吐溫-80充分混合后用無菌水調節至10 mL，即得1 g/mL的濃縮液。高壓蒸汽滅菌備用［9］。

1.2.4菌種的復壯與擴增腸炎沙門菌接種于LB固體培養基上，37℃培養18～24 h，復壯后，取菌種一環置于LB液體培養基內，37℃培養24 h，再用肉湯液做1∶500倍稀釋備用。

1.2.5牛津杯法取菌液100 μL置于LB瓊脂平板表面，用涂布器反復涂布均勻后置于37℃恒溫箱中10 min，表面干燥后取出，在每個平板上等距離平放打有標記的牛津杯6只，每只杯內分別加入等量的不同濃度的藥液240 μL，于37℃培養24～48 h，每種濃度設置6個重復。

1.2.6最小抑菌濃度試驗采用平板法，用超純水按試管二倍稀釋法稀釋提取物的5種不同濃度：1、0.5、0.25、0.125、0.0625 g/mL，分別按1∶9的比例在已融化的營養瓊脂培養基中加入每一種稀釋倍數的提取物，使藥物濃度為：0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625 g/mL，對照用10 mL營養瓊脂培養基，包扎好高壓滅菌，待溫度降至50℃左右倒入60 mm滅菌的培養皿中。待冷卻凝固后放入37℃溫箱中干燥2 h，取出平皿冷卻后加入50 μL菌懸液，用滅菌涂布器涂均勻，再放入37℃溫箱培養24 h，對照平皿不加菌液。每種提取物設3個重復。

1.2.7抑菌試驗結果判斷抑菌效果判定，抑菌直徑≥20 mm為極敏，用“++++”表示；15～19 mm為高敏，用“+++”表示；10～l4為中敏，用“++”表示；10 mm以下為低敏，用“+”表示；無抑菌圈為耐藥［10］。

1.2.8最低抑菌濃度結果判斷在對照皿無細菌生長的前提下記錄結果，“-”表示平板無細菌生長，“+”表示平板有細菌生長，

2　結果

2.1抑菌試驗結果3種提取物3種濃度對腸炎沙門菌的抑菌效果見表1。從表1可以看出，馬齒莧水提物和醇提物濃度為1 g/mL時，腸炎沙門菌對其表現為極敏，對水煮醇提物表現為高敏。提取物濃度為0.5 g/mL時，腸炎沙門菌對水提物表現為極敏，對醇提物和水煮醇提物表現為高敏。濃度為0.25 g/mL時，腸炎沙門菌對馬齒莧水提物和醇提物表現為高敏，對水煮醇提物表現為中敏。

表1　3種提取物3種濃度對腸炎沙門菌的抑菌效果（平均抑菌圈直徑mm）

2.2最低抑菌濃度試驗結果見表2。

表2　3種提取物對腸炎沙門菌的最小抑菌濃度（g/mL）的抑菌效果

從表2可知，馬齒莧水提物、醇提物和水煮醇提物對腸炎沙門菌的最小抑菌濃度分別為0.025、0.025 g/mL和0.050 g/mL。

3　分析與討論

3.1馬齒莧性寒，味甘酸；入心、肝、脾、大腸經，具有清熱解毒，涼血止血，止痢的功效。馬齒莧3種提取物同濃度對腸炎沙門菌均有顯著的抑菌作用，且隨藥物濃度的增加而增強。在實踐中，馬齒莧常用來防治畜禽下痢，可單用或和其他藥物配伍使用。其中水提物略優于醇提和水煮醇提物，但不易保存。水煮醇提工藝可制成注射液，使用方便，見效快。在生產實踐中，可以根據季節及生產條件，選擇合適的提取工藝。

3.2馬齒莧水提物和醇提物在濃度為0.025 g/mL時，平皿無細菌生長，在0.0125 g/mL時，有細菌生長；水煮醇提物在濃度為0.05 g/mL時，平皿無細菌生長，在0.025 g/mL時，有細菌生長，因此3種提取物對腸炎沙門菌的最小抑菌濃度（MIC）即為最小殺菌濃度（MBC）。

3.3馬齒莧含有黃酮類、萜類、香豆素類、生物堿類、揮發油類及多糖類等多種活性成分［2］。馬齒莧提取物是多種物質的混合物，其中究竟是何種物質對腸炎沙門菌具有抑制作用，有待進一步研究。

3.4馬齒莧適應性極強，易于人工大量栽培，且價格低廉。隨著健康、綠色、安全、生態養殖的倡導，中草藥在畜牧養殖中的開發得到廣泛關注，因馬齒莧的氣味和味道不具有通常中草藥的苦味，適口性好，廣泛應用于畜禽飼料中。本試驗為馬齒莧作為畜牧業新型綠色中草藥添加劑，減少抗生素的使用和提高食品安全性，同時也為中藥現代化提供理論依據。

［1］衛法監發＜2002＞15號，《關于進一步規范保健食品原料管理的通知》［s］.

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［3］楊明凡，張素梅，唐湛偉，等.馬齒莧不同加工方法對體外抑菌效果的影響［J］.中獸醫醫藥雜志，2006，5：19.

［4］張京芳.馬齒莧黃酮類物質提取工藝研究［J］.西北林學院學報，2004，19（4）：123-126.

［5］章愛華，鄧斌，陳小原.馬齒莧中黃酮類化合物的提取工藝研究［J］.農產品加工：學刊，2008（5）：18-19.

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［7］黃春紅，殷武平，郝小花.野生馬齒莧草粉總黃酮的提取及含量測定［J］.湖北農業科學，2011，50（7）：1462-1464.

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［9］南京藥學院.藥劑學［M］.北京：人民衛生出版社，1978：269.

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S852.61+2

B

0529-6005（2016）04-0071-02

2015-04-01

福建省教育廳A類項目（JA13309）；龍巖學院服務海西建設項目（LQ2013027）

周孝瓊（1977-），女，實驗師，本科，研究方向為獸醫臨床學，E-mail：zhouxq1977@163.com

王華，E-mail：whomer@163.com