應用液相阻斷ELISA試驗和正向間接血凝試驗（IHA）檢測豬O型口蹄疫抗體的比較分析

劉　陽，韋選民，張智鵬，李艷明，熊偉曼，張　靖，趙　力

（陜西省漢中市動物疾病預防控制中心，陜西 漢中 723000）

應用液相阻斷ELISA試驗和正向間接血凝試驗（IHA）檢測豬O型口蹄疫抗體的比較分析

劉陽，韋選民，張智鵬，李艷明，熊偉曼，張靖，趙力

（陜西省漢中市動物疾病預防控制中心，陜西 漢中 723000）

口蹄疫，是由口蹄疫病毒引起的急性、熱性、高度接觸性傳染病，易感動物達70多種，主要侵害偶蹄類動物，少見于人。豬口蹄疫是國家要求強制免疫的重大動物疫病之一，對其免疫抗體檢測的科學、準確性對有效防控口蹄疫尤為重要，但在實際檢測過程中，常因檢測方法不同而使檢測結果有所差異，即使同一份血清用不同檢測方法，其監測結果不一致的現象時有發生。

目前實驗室檢測豬O型口蹄疫抗體的方法，主要有液相阻斷ELISA試驗和正向間接血凝試驗（IHA）。液相阻斷ELISA試驗農業部規定的抗體合格判定標準與試劑盒說明書一致，IHA試驗農業部規定的抗體合格判定標準與試劑盒說明書存在差異，在實際檢測過程中，無論IHA采用哪種結果判定標準，二者檢測結果不一致的現象時有發生。為此本試驗選擇這兩種方法分別對284份豬血清樣品進行O型口蹄疫免疫抗體平行對比檢測，針對不同的（IHA）結果判定標準詳細比較二者檢測結果的一致性，從而找出影響兩種檢測方法結果一致的因素，對兩種方法提出較為客觀、公正的評價，為實驗室口蹄疫抗體檢測方法的選擇提供參考依據。

1　材料與方法

1.1樣品血清樣品來自口蹄疫疫苗比對試驗所采豬血清，共檢測豬血清284份。

1.2試劑口蹄疫O型正向間接血凝抗體檢測試劑盒，批號2014081804。口蹄疫O型液相阻斷ELISA抗體檢測試劑盒，批號：2014063001，抗原批號：2014062501，抗原使用濃度1∶11。以上均購自中國農業科學院蘭州獸醫研究所。

1.3儀器設備單道、8道微量移液器，均購自德國Brand公司；酶標儀型號為MULTISKAN FC，賽默飛世爾（上海）儀器有限公司生產；電熱恒溫培養箱型號為DHP-9162，上海一恒科學儀器有限公司生產；超純水儀型號為UPH-11-20T，成都超純科技有限公司生產。

1.4檢測方法與結果判定標準正向間接血凝試驗按試劑盒說明書進行操作。按農業部［農醫發（2012）2號］文件要求，判定標準：其有效抗體≥1∶32（第5孔）呈現“++”凝集為免疫合格；按中國農業科學院蘭州獸醫研究所試劑說明書要求，判定標準：其有效抗體效價≥1∶128（第7孔），呈現“++”凝集為免疫合格。

液相阻斷ELISA試驗按試劑盒使用說明書進行操作，波長492 nm，病毒抗原對照D492 nm在1.5±0.5范圍內，陽性對照抗體效價在1∶1024±1滴度以內，陰性對照血清抗體效價＜1∶8，試驗算成立。樣品結果判定方法依據試劑盒說明書結果判定方法進行判定，判定標準：豬血清抗體效價≥1∶64為免疫合格（與農業部規定標準一致）。

2　結果與分析

2.1ELISA和IHA不同判定標準樣品合格率的比較由表1可見，總樣本液相阻斷ELISA試驗的合格率為44.72%（127/284）；正向間接血凝試驗（IHA）按農業部標準（抗體滴度≥25）的合格率為66.20%（188/284），按試劑說明書要求（抗體滴度≥27）的合格率為20.77%（59/284），按本試驗設計標準（抗體滴度≥26）的合格率為41.20%（117/284）。由此可見，農業部要求的正向間接血凝（IHA）的檢測合格率明顯高于液相阻斷ELISA的檢測合格率，誤差率高達21.48%（61/284），經X2檢驗差異極顯著（P＜0.01），其結果與周家喜等［1］、陳桂英［2］的試驗結果一致；按試劑盒說明書要求的正向間接血凝試驗結果判定標準，其檢測合格率明顯低于液

相阻斷ELISA的檢測合格率，誤差率23.59%（68/ 284），經X2檢驗差異極顯著（P＜0.01）。而按本試驗設計的正向間接血凝試驗判定標準，其檢測合格率與液相阻斷ELISA試驗基本一致，誤差率僅為3.52%（10/284），經X2檢驗差異不顯著（P＞0.05）。說明以本試驗設計標準為IHA判定標注，其檢測合格率與液相阻斷ELISA試驗基本一致，過高或過低的IHA判定標準都會影響其與ELISA合格率的一致性。

2.2ELISA與IHA重復性比較由表2可見，在284份樣品中，ELISA方法檢測合格127份，同時IHA方法檢測合格108份（抗體滴度≥25）或45份（抗體滴度≥27），ELISA方法檢測不合格157份，同時IHA方法檢測不合格81份（抗體滴度＜25）或147份（抗體滴度＜27）；總樣本中兩種檢測方法相一致的符合率為66.55%（189/284）、67.61%（192/284）。說明IHA方法與ELISA方法檢測數的符合率差異，與IHA采用不同的抗體合格判定標準無關。

表1　284份樣品ELISA和IHA檢測結果比較　單位：份、%

表2　ELISA與IHA不同判定標準結果符合率比較

2.3IHA抗體滴度與ELISA相關性的分析由表3可見，在以抗體滴度≥25為判定標準的IHA檢測合格188份中，同時ELISA檢測不合格78份，誤差率41.49%（78/188）；在以抗體滴度≥27為判定標準的IHA檢測合格59份，同時ELISA檢測不合格10份，誤差率16.95%（10/59），其中有2份抗體滴度在7孔以上，ELISA檢測卻不合格。說明IHA檢測判定標準越高，與ELISA合格數的誤差率越低，同時也說明ELISA檢測方法同樣也會出現一定誤差。

2.4IHA抗體滴度大小與ELISA抗體滴度相關性比較由表4可得，用IHA檢測抗體滴度≥25，同時ELISA檢測抗體滴度≥1∶22的樣品共56份，其中有37份ELISA檢測抗體滴度在1∶45-1∶90之間，占總樣品的66.07%（37/56）；用IHA檢測抗體滴度≥26，同時ELISA檢測抗體滴度≥1∶22的樣品共54份，其中有32份ELISA檢測抗體滴度≥1∶90，占總樣品的59.26%（32/54）；用IHA檢測抗體滴度≥27，同時ELISA檢測抗體滴度≥1∶22的樣品共32份，其中有26份ELISA檢測抗體滴度≥1∶90，占總樣品的81.25%（26/ 32）；用IHA檢測抗體滴度≥28，同時ELISA檢測抗體滴度≥1∶22的樣品共11份，其中有10份ELISA檢測抗體滴度≥1∶90，占總樣品的90.91%（10/11）；用IHA檢測抗體滴度≥29，同時ELISA檢測抗體滴度≥1∶22的樣品共12份，其中有12份ELISA檢測抗體滴度≥1∶90，占總樣品的100%（12/12）。說明用IHA檢測樣品抗體滴度越高，用ELISA檢測抗體滴度也越高。

表3　IHA抗體滴度大小ELISA合格數的誤差關系

由表5可見，ELISA檢測出的相同抗體滴度的樣品，再用IHA檢測抗體滴度分布范圍較廣，但絕大多數分布在相近的抗體滴度范圍內，同時ELISA檢測抗體滴度越高，IHA檢測抗體滴度也越高。

表4　IHA檢測不同抗體滴度對應ELISA檢測結果分布統計

表5　ELISA抗體滴度大小與IHA抗體滴度相關性比較

3　討論

3.1按農業部標準，其有效抗體≥25（第5孔）為免疫合格時，IHA的檢測合格率明顯高于ELISA的檢測合格率。若以IHA試劑盒說明書標準，其有效抗體≥27（第7孔）為免疫合格時，IHA的檢測合格率又明顯低于ELISA的檢測合格率。而以本試驗設計標準為準，其有效抗體≥26（第6孔）為免疫合格時，IHA的檢測合格率與ELISA檢測合格率基本一致，這說明IHA的判定標準對樣品合格率的影響較大，選用合適的IHA判定標準，可以提高這兩種試驗檢測結果的一致性。

3.2在ELISA和IHA的相關性比較中，IHA判定標準越高，其檢測結果與ELISA檢測結果的符合率越高。分析原因，主要是IHA敏感性較高，特異性卻很低，容易產生假陽性，且試驗結果主要通過肉眼觀察，主觀性強；ELISA敏感性較低，特異性卻很高，樣品抗體水平較高時，ELISA更容易檢測出陽性，且試驗結果全部通過儀器測量，人為因素干擾小，結果準確性更高。試驗中用IHA檢測抗體滴度等于5的樣品共71份，對這71份樣品再用ELISA檢測卻只有29份合格；IHA檢測抗體滴度≥9的樣品共13份，用ELISA檢測時有12份合格，也說明了IHA敏感性高，特異性低，會產生假陽性，ELISA敏感性較低，特異性較高。

3.3IHA檢測出的不同抗體滴度的樣品，再用ELISA檢測，抗體滴度分布較廣，但絕大多數分布在相近的抗體滴度范圍內（從表4和表5中可以看出）。分析原因主要是IHA檢測人為因素干擾較大，主觀性較強，存在非特異性凝集，導致IHA檢測抗體滴度很高，ELISA檢測抗體滴度卻很低。

3.4目前IHA試驗，仍是我國運用最為廣泛的口蹄疫免疫抗體監測方法，這也是行業標準中推薦的方法之一，而液相阻斷ELISA方法作為一種生物學方法，也常常被用來檢測其抗體，同時也是國家推薦使用的方法。IHA的原理是利用提純的口蹄疫病毒致敏于醛化綿羊紅細胞上，制成口蹄疫血凝抗原，用于檢測血清中的抗體水平。該方法簡單易行，適合于基層單位應用，但特異性低，有假陽性現象。在國際上該方法已不再使用。液相阻斷ELISA試驗原理是抗原抗體在液相中反應，與病毒中和試驗原理相似，又被稱為體外病毒中和試驗，是國際獸醫局（OIE）推薦的監測口蹄疫病毒抗體的標準方法。

4　結論

（1）IHA試驗使用儀器設備少，操作簡便快速，試劑盒價格低廉；而ELISA試驗，要求技術人員操作熟練，使用儀器設備多，操作步驟繁瑣，耗時較長，且試劑價格昂貴。在基層運用較多的還是IHA試驗，而且IHA也是國家允許使用的口蹄疫抗體檢測方法，因此在基層，實驗條件不好的地方，如能科學地應用，IHA方法仍不失為基層較好的檢測方法；在小范圍抽樣下，實驗條件較好的地方，應使用OIE標準和農業部標準中均采用的液相阻斷ELISA方法［3］。

（2）從診斷試劑穩定性來看，ELISA試劑性能穩定，重復性好，而IHA試劑性能穩定性不夠好，重復性差。因此，基層采用IHA來評估口蹄疫免疫抗體水平，需要提高檢測技術和判定標準，以減少誤判。

（3）在每年的重大動物疫病防控效果考評中，政府都要投入大量的人力、物力、財力進行抽樣檢測，評估免疫效果，但檢測結果常因檢測方法或檢測試劑不同而不盡一致，給免疫效果評估工作帶來了不便，同時也干擾了口蹄疫的防控工作。因此，選擇一種可靠的、通用的口蹄疫免疫抗體檢測方法來指導基層動物防疫工作，科學準確評價動物群體免疫狀況和抗感染能力，才能最終達到有效控制口蹄疫的效果。

［1］周家喜，鄧銓濤，余波，等.豬口蹄疫免疫抗體不同檢測方法的對比試驗［J］.中國畜禽種業，2009（7）：149-150.

［2］陳桂英.不同方法檢測O型口蹄疫免疫抗體的對比試驗［J］.黑龍江畜牧獸醫，2011（16）：101-102.

［3］GB/T 18935-2003，口蹄疫診斷技術［S］.北京：中國標準出版社，2003-05-01.

S852.52

B

0529-6005（2016）04-0061-03

2015-01-16

劉陽（1987-），男，助理獸醫師，本科，主要從事動物疫病防控工作，E-mail：814222659@qq.com

韋選民，E-mail：fffsys2255543@126.com