不同銅源對Caco-2細胞內銅-ATP酶二價金屬離子轉運體1和金屬硫蛋白含量的影響

高　晨，朱連勤，朱風華，王學鑫，張　婷，張　靜

（1.青島農業大學動物科技學院，山東 青島 266109；2.德州學院農學系，山東 德州 253023）

不同銅源對Caco-2細胞內銅-ATP酶二價金屬離子轉運體1和金屬硫蛋白含量的影響

高晨1，2，朱連勤1，朱風華1，王學鑫1，張婷1，張靜1

（1.青島農業大學動物科技學院，山東 青島 266109；2.德州學院農學系，山東 德州 253023）

利用Caco-2細胞模型研究不同濃度硫酸銅，微米氧化銅，納米氧化銅（銅水平2、4、8、16 mg/L）對細胞銅-ATP酶、二價金屬離子轉運體1（Divalent Metal Transporter 1，DMT1）、金屬硫蛋白（metallothionein，MT）含量的影響。結果顯示，培養液中添加銅離子能提高Caco-2細胞銅-ATP酶、MT含量，低濃度銅離子能提高細胞DMT1含量，高濃度銅離子降低細胞DMT1含量。納米氧化銅對幾種銅轉運蛋白的作用與硫酸銅類似，但納米氧化銅對銅-ATP酶、MT、DMT1含量的影響更加明顯。

納米氧化銅；Caco-2細胞；銅-ATP酶；金屬硫蛋白；二價金屬離子轉運體1

銅作為機體必需的微量元素之一。目前飼料中常用的銅源有硫酸銅和氧化銅等，但傳統銅源存在吸收率低、污染環境等缺點。隨著納米科技的興起，納米微量元素添加劑步入人們視野，有研究表明，飼料中添加納米氧化銅效果優于硫酸銅和氧化銅，其生物學作用強，生物利用率高［1-3］。然而，納米氧化銅在動物體內吸收轉運機制并不清楚，仍需進一步研究。本試驗以Caco-2細胞為模型，研究不同銅源對銅-ATP酶、金屬硫蛋白（metallothionein，MT）、二價金屬離子轉運體1（Divalent Metal Transporter 1，DMT1）的影響，探討納米氧化銅在吸收轉運時的特點，為進一步研究和開發納米氧化銅提供參考數據。

1　材料與方法

1.1細胞株Caco-2細胞，購自中國科學院上海細胞庫。

1.2試驗設計將Caco-2細胞按1×105/mL的濃度接種于6孔板中，在37℃、5%CO2下培養20 d后，換入含有不同銅源的DMEM培養液（3 mL/孔）。設12個試驗組，硫酸銅、微米氧化銅和納米氧化銅3種銅源分別設4個組（銅水平2、4、8、16 mg/L）；對照組加培養液3 mL/孔；每組6個重復。繼續作用24 h后，收集細胞檢測相關指標。

1.3檢測指標與方法采用BCA法檢測Caco-2細胞蛋白含量。利用銅-ATP酶測試盒、金屬硫蛋白測試盒、二價金屬離子轉運體測試盒檢測Caco-2細胞中銅-ATP酶、MT、DMT1含量。

1.4數據分析利用SPSS17.0統計軟件進行分析，數據處理應用單因素方差分析和LSD多重比較。數據均采用-X±SD表示。

2　結果

2.1不同銅源對Caco-2細胞內銅-ATP酶活性的影響結果顯示，培養液銅水平為2、4 mg/L時，添加納米氧化銅組的銅-ATP酶活性高于硫酸銅和微米氧化銅組（P＜0.05）。培養液銅水平為8 mg/L時，添加硫酸銅組的銅-ATP酶活性高于納米氧化銅組（P＜0.05）。硫酸銅和納米氧化銅對Caco-2細胞銅-ATP酶活性的影響均呈現隨著銅濃度升高先上升后下降趨勢（P＜0.05）。見表1。

表1　不同銅源對Caco-2細胞銅-ATP酶活性的影響（μmolPi/mgprot/hour）

2.2不同銅源對Caco-2細胞內MT含量的影響

結果顯示，培養液中添加同等銅水平時，納米氧化銅組Caco-2細胞MT含量高于硫酸銅組和微米氧化銅組（P＜0.05）。納米氧化銅和硫酸銅對Caco-2細胞MT含量的影響均呈現隨培養液銅濃度的升高而升高（P＜0.05）。見表2。

表2　不同銅源對Caco-2細胞MT含量的影響（μg/gprot）

2.3不同銅源對Caco-2細胞內DMT1含量的影響結果顯示，培養液銅水平為2 mg/L時，添加硫酸銅Caco-2細胞DMT1含量高于納米氧化銅和微米氧化銅（P＜0.05）。銅水平為4 mg/L時，添加硫酸銅和微米氧化銅Caco-2細胞DMT1含量高于納米氧化銅（P＜0.05）。銅水平為8、16 mg/L時，添加微米氧化銅Caco-2細胞DMT1含量高于硫酸銅和納米氧化銅（P＜0.05）。納米氧化銅和硫酸銅對Caco-2細胞DMT1含量的影響均呈現隨銅濃度的升高而下降（P＜0.05）。見表3。

3　討論

銅-ATP酶存在于細胞質膜、內質網和高爾基體等亞細胞器中，在調節細胞Cu吸收和平衡方面有重要作用［4］。Xie等報道，添加銅能明顯提高大鼠腸上皮細胞中銅-ATP酶（ATP7A）活性［5］。本試驗發現，添加低濃度納米氧化銅能提高Caco-2細胞中銅-ATP酶活性，但當添加高濃度納米氧化銅時，銅-ATP酶的活性又回落至正常水平，甚至略有下降。可能是由于細胞在短時間內積聚大量的銅，進而細胞通過負反饋調控進入細胞中的銅離子量，是細胞避免銅中毒的一種保護性反應。硫酸銅對銅-ATP酶活性的影響與納米氧化銅相似。同時發現，納米氧化銅對銅-ATP酶活性的影響要強于相同濃度的硫酸銅，可能是納米氧化銅以銅離子和納米粒子兩種形式進入細胞，通過兩種途徑對細胞銅-ATP酶活性產生影響。添加微米氧化銅后對銅-ATP酶活性沒有影響。MT是一類與金屬元素具有高度親和力且能被其誘導的功能特異的蛋白質。銅與MT結合成Cu-MT，保持細胞內銅濃度相對穩定，有效地減低銅的細胞毒性。Darwish等報道，大鼠肝臟細胞中的MT mRNA的表達水平與銅濃度呈正相關［6］。進一步研究發現，在一定濃度范圍內，隨著培養液中納米氧化銅水平的升高，Caco-2細胞MT mRNA相對表達量明顯升高［7］。本試驗發現，隨培養液中銅離子濃度增加，Caco-2細胞中MT的含量顯著增高，納米氧化銅對細胞中MT含量影響與硫酸銅類似，但是同等濃度的納米氧化銅比硫酸銅更能促進MT的生成。DMT1在腸中主要分布于十二指腸絨毛刷狀緣等處，DMT1除了攝取Fe2+外，也能對銅離子進行轉運［8］。Jiang等對小鼠HEK-293細胞研究發現，隨著細胞銅轉運量增加，DMT1 mRNA的表達受到抑制［9］。本試驗發現，隨著培養液中納米氧化銅濃度的增加，細胞DMT1的生成受到抑制，同時發現同等濃度下納米氧化銅對DMT1的抑制作用要強于硫酸銅，可能是由于納米氧化銅以銅離子和納米粒子2種形式進入細胞為細胞提供了更多的銅，進而抑制DMT1的生成。

表3　不同銅源對Caco-2細胞DMT1含量的影響（μg/gprot）

本試驗發現，納米氧化銅對幾種銅轉運蛋白的作用與微米氧化銅有較大差異，反而與硫酸銅類似，說明納米氧化銅在培養液中部分以銅離子形態存在。但納米氧化銅對銅-ATP酶、MT、DMT1含量的影響更明顯，因為納米氧化銅除了以銅離子形式進入細胞外，還以納米粒子形式直接進入細胞，通過2種途徑來對細胞的銅轉運蛋白產生影響。

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Effects of different sources of copper on copper-ATPase，divalent metal transporter content 1，metallothionein in Caco-2 cells

GAO Chen1，2，ZHU Lian-qin1，ZHU Feng-hua1，WANG Xue-xin1，ZHANG Ting1，ZHANG Jing1
（1.College of Animal Science and Veterinary Medicine，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China；2.Department of Agronomy，Dezhou University，Dezhou 253023，China）

In this study，we investigated the effects of different concentrations of CuSO4，micron-CuO，nano-CuO（copper levels 2，4，8，16 mg/L）on cell copper-ATPase，DMT1，MT content in Caco-2 cell.The results showed that the culture medium supplemented with copper ions improve the copper-ATPase，and MT content in Caco-2 cells.Low concentrations of copper ions improved DMT1 content and high concentrations of copper ions reduced DMT1 content in Caco-2 cells.Effect of nano-CuO on several copper transporters was similar to CuSO4，but the impact of nano-CuO to copper-ATPase，MT，DMT1 content was more obvious.

Nano-CuO；Caco-2 cell；copper-ATPase；MT；DMT1

ZHU Lian-qin

S852.3

A

0529-6005（2016）04-0049-02

2014-11-26

國家自然科學基金科學部主任基金項目（311400-76）；青島市科技計劃基礎項目［12-1-4-5-（5）-jch］

高晨（1979-），男，講師，博士，研究方向為動物營養代謝病與中毒病，E-mail：gaochen1127@126.com

朱連勤，E-mail：lqzhu@qau.edu.cn