腹腔注射不同劑量DON對肉雞免疫功能及血液生化指標的影響

黃　凱，朱風華，宋明明，徐　丹，王　赫，張瑞星，朱連勤

（青島農業大學動物科技學院，山東 青島 266109）

腹腔注射不同劑量DON對肉雞免疫功能及血液生化指標的影響

黃凱，朱風華，宋明明，徐丹，王赫，張瑞星，朱連勤

（青島農業大學動物科技學院，山東 青島 266109）

本試驗對腹腔注射不同劑量的脫氧化雪腐鐮刀菌烯醇（DON）對肉雞的毒性作用進行了研究。將32只AA肉公雞隨機分為4組，每組8只。1組為對照組，腹腔注射生理鹽水，2～4組為試驗組，分別腹腔注射含10、50、100 μg/mL的DON生理鹽水溶液1 mL。每天注射1次，試驗期35 d。結果顯示，DON中高劑量組IL-4、IL-6、IgA、IgM、ND和IBD抗體水平、GSH-Px活性、總抗氧化能力顯著低于對照組（P＜0.05），各試驗組谷丙轉氨酶活性顯著高于對照組（P＜0.05），DON高劑量組脾臟淋巴細胞轉化率、外周血淋巴細胞轉化率顯著低于其他各組（P＜0.05）。由此可見DON對肉雞具有明顯的氧化損傷和免疫毒性，且呈劑量相關性。

DON；腹腔注射；肉雞；氧化損傷；免疫功能

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）是存在于糧食和飼料中的主要真菌毒素之一［1］。杜妮［2］在2013年檢測動物配合飼料，發現DON檢出率達98.02%、最高值為5 665.30 μg/kg、平均值為1 195.50 μg/kg，均高于豬配合飼料限量標準（1 000 μg/kg）。王金勇等［3］在2013年檢測了豬禽飼料，發現豬飼料DON最高值為4 773 μg/kg、平均值為592 μg/kg；禽飼料最高值為2 838 μg/kg、平均值為616 μg/kg。DON在飼料中的污染狀況引起了飼料和養殖業界的高度關注。許多研究證明，DON具有免疫毒性和氧化損傷作用。但是，關于DON對家禽毒性研究鮮有報道。本試驗采用腹腔注射的攻毒方式，探討DON對肉雞的免疫毒性及氧化損傷，進一步闡釋DON致肉雞中毒的機理。

1　材料與方法

1.1試驗動物與處理選32只1日齡健康AA肉雞隨機分為4組，1組為對照組，腹腔注射生理鹽水1 mL；2、3、4組為試驗組，分別腹腔注射含DON 10、50、100 μg/mL的生理鹽水溶液1 mL，每天注射1次。試驗期35 d。

1.2飼養管理飼喂全價顆粒料，自由采食和飲水。7日齡，接種新城疫Ⅳ系、傳支H120二聯凍干苗，雙倍點眼滴鼻免疫；14日齡，接種傳染性囊病疫苗，雙倍飲水。21日齡，接種新城疫Ⅳ系疫苗，雙倍飲水。

1.3試劑與藥品DON純品、ConA和MTT，購自美國Sigma公司；RPMI-1640，購自美國GIBCO公司；胎牛血漿，購自杭州四季青生物工程材料研究所；谷草轉氨酶（AST）、谷丙轉氨酶（ALT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、總抗氧化能力（T-AOC）、IgG、IgM、IgA、IL-2、IL-4、IL-6檢測試劑盒、二甲基亞砜，均購自南京建成生物工程研究所。新城疫抗體（NDV-Ab）、傳染性囊病抗體（IBDV-Ab）檢測試劑盒，購自上海勁馬生物科技有限公司。

1.4檢測指標與方法

1.4.1血漿中免疫指標的測定對32只肉雞進行心臟采血，肝素鈉抗凝，3 000 r/min離心15 min，取上層血漿，用酶聯免疫法檢測血漿中IL-2、IL-4、IL-6、IgA、IgG、IgM、NDV-Ab、IBDV-Ab的含量。

1.4.2血漿中生化指標的測定用比色法檢測血漿中T-AOC、GSH-Px、ALT、AST的活性。

1.4.3外周血、脾臟淋巴細胞轉化率的測定每組隨機取4只雞，心臟無菌采血2 mL，肝素鈉抗凝，取1 mL用Hank′s液1∶1稀釋，用淋巴細胞分離液進行外周血淋巴細胞分離，分離的外周血淋巴細胞用PBS洗滌兩次，最后用RPMI 1640完全培養液洗滌一次，重懸，計數，并用臺盼藍檢測細胞活力大于95%，將外周血淋巴細胞的濃度調成2.0×106個/mL備用。接著無菌條件下，將雞的脾臟取出，放入盛有PBS的培養皿內，用PBS輕輕清洗掉脾臟周圍的血液殘渣，剝離脾臟周圍的結締組織，將其放入200目篩網上，用鑷子撕碎，用20 mL一次性注射器的內芯輕輕研磨、過濾，用淋巴細胞分離液分離脾臟淋巴細胞，分離的脾臟淋巴細胞用PBS洗滌兩次，最后用RPMI 1640完全培養液洗滌一次，重懸，計數，并用臺盼藍檢測細胞活力大于95%，將脾臟淋巴細胞的濃度調成2.0×106個/ mL。采用MTT法檢測雞外周血和脾臟淋巴細胞轉化率。將淋巴細胞加入96孔細胞培養板，每孔100 μL，另設培養基空白對照組（無淋巴細胞，只含RPMI-1640和ConA），每孔加入10 μL 100 μg/ mL的ConA。設5個重復。培養72 h，培養終止前4 h，每孔加入濃度為5 mg/mL的MTT 10 μL，培養至終止，每孔加100 μL二甲基亞砜（DMSO），吹打混勻，靜置10 min，使細胞內結晶物完全溶解，用酶標儀測定OD490nm值。計算淋巴細胞轉化率：

淋巴細胞轉化率=（試驗組OD值-空白對照組OD值）/空白對照組OD值

1.5數據統計分析試驗數據采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析（one-way ANOVA）和最小顯著差異法（LSD）對各均值進行多重比較，結果用±SD表示。

2　結果

2.1注射不同劑量DON對肉雞血漿細胞因子和抗體水平的影響腹腔注射含DON 10-100 μg/mL的生理鹽水溶液組，肉雞血漿IL-2、IL-6、IgA和IgM含量顯著低于對照組（P＜0.05）。腹腔注射含DON 50、100 μg/mL組，肉雞血漿IL-4含量和NDV-Ab水平顯著低于對照組和腹腔注射含DON 10 μg/mL組（P＜0.05）。腹腔注射含DON 50、100 μg/mL組，IBD-Ab水平顯著低于對照組（P＜0.05），見表1。

2.2注射不同劑量DON對血漿生化指標的影響

試驗至42 d，腹腔注射含DON 50 μg/mL和100 μg/mL組，肉雞血漿T-AOC水平顯著低于對照組和腹腔注射含DON 10 μg/mL組（P＜0.05）。腹腔注射含DON 10-100 μg/mL組，肉雞血漿GSH-Px活性顯著低于對照組（P＜0.05），肉雞血漿ALT水平顯著高于對照組（P＜0.05），見表2。

表1　不同注射劑量DON對肉雞血漿細胞因子和抗體水平的影響

表2　不同注射劑量DON對血液生化指標的影響單位：U/L

2.3注射不同劑量DON對肉雞脾臟淋巴細胞轉化率以及外周血淋巴細胞轉化率的影響腹腔注射含DON 100 μg/mL組，肉雞脾臟和外周血LTR顯著低于其他各組（P＜0.05），其他各組差異不顯著（P＞0.05），見表3。

表3　不同注射劑量DON對肉雞淋巴細胞轉化率的影響

3　討論

本試驗發現，給肉雞連續35 d腹腔注射1 mL含DON 10、50、100 μg/mL的生理鹽水溶液，NDV和IBDV抗體水平呈現下降的趨勢；注射1 mL含DON 50 μg/mL和100 μg/mL的生理鹽水溶液時，NDV抗體水平顯著下降；注射1 mL含DON 100 μg/mL的生理鹽水溶液時，IBDV抗體水平顯著下降。Harvey等［4］給肉雞飼喂含DON 50 mg/kg的日糧，降低肉雞血清NDV和IBDV抗體濃度。D?nicke等［5］報道，用主要含DON（含量分別為3.5、7.0、10.5 mg/kg和14.0 mg/kg）的小麥飼喂肉雞，發現血清NDV抗體滴度明顯降低，且呈明顯的濃度依賴性。本試驗還發現，給肉雞連續35 d腹腔注射1 mL含DON 10、50、100 μg/mL的生理鹽水溶液，顯著降低血漿IgA和IgM含量。Warner等［6］通過鼠脾臟淋巴細胞體外試驗也證明，培養基質中DON濃度在10 μg/mL～1 000 μg/mL時，能降低培養基質中IgA、IgG、IgM的含量。本試驗還發現，注射1 mL含DON 100 μg/mL的生理鹽水溶液時，脾臟淋巴細胞和外周血淋巴細胞轉化率顯著降低。Ouyang等［7］研究顯示，培養的CD4+T細胞在DON（50～500 μg/mL）作用下，低濃度DON（50 μg/mL和100 μg/mL）能延遲或損害細胞增殖，而高濃度下DON（250～500 μg/mL）能完全抑制細胞增殖。Harvey等［4］給肉雞飼喂含DON 50 mg/kg的日糧，發現DON能夠抑制促進淋巴細胞分裂的有絲分裂原的產生。Warner等［6］通過體外試驗也證明，培養基質中DON濃度在10～1 000 μg/mL時，能抑制鼠脾臟淋巴細胞DNA、蛋白質的合成。給肉雞連續35 d腹腔注射1 mL含DON 10、50、100 μg/mL的生理鹽水溶液，顯著降低肉雞血漿IL-2、IL-4和IL-6含量。可以看出，嘔吐毒素對肉雞細胞免疫和體液免疫產生不利影響，染毒劑量越高越嚴重。

本試驗發現，給肉雞連續35 d腹腔注射1 mL含DON 50和100 μg/mL的生理鹽水溶液，肉雞血液總抗氧化能力顯著降低，血漿GSH-Px活性顯著下降，血漿AST和ALT活性顯著升高。Kouadio等［8］用DON（5-40 μmol/L）處理Caco-2細胞24 h，發現DON可以阻斷Caco-2細胞鞘磷脂代謝，導致脂質過氧化，改變細胞膜的結構而導致細胞死亡，使細胞MDA增加，細胞抗氧化能力下降。Chen等［9］試驗結果顯示，給仔豬連續6周飼喂含DON 1 mg/kg飼料，明顯提高AST和ALT活性。由此可見，DON具有明顯的氧化損傷作用并造成肝臟損害。

［1］Plattner R D，Maragos C M.Determination of deoxynivalenol and nivalenol in corn and wheat by liquid chromatography with electrospray mass spectrometry［J］.Journal of AOAC International，2003，86（1）：61-65.

［2］杜妮.2013年我國部分地區飼料及原料霉菌毒素污染調査報告［J］.今日養豬業，2014，3：48-52.

［3］王金勇，劉穎莉，關舒.2013年中國飼料和原料霉菌毒素檢測報告［J］.國外畜牧學-豬與禽，2014，34（2）：49-51.

［4］Harvey R B，Huff W E，Elissalde M H，et al.Heamatologic and immunologic toxicity of deoxynivalenol（DON）-contaminated diets to growing chickens［J］.Bull Environ Contam and Toxicol，1991，46（3）：410-416.

［5］D?nicke S，Matthes S，Halle I，et al.Effects of graded levels of Fusarium toxin contaminated wheat and of a detoxifying agent in broiler diets on performance，nutrient digestibility and blood chemical parameters［J］.Poultry Science，2003，44（1）：113-126.

［6］Warner R L，Brooks K，Pestka J J.In vitro effects of vomitoxin（deoxynivalenol）on T-cell interleukin production and IgA secretion［J］.Food and Chemical Toxicology，1994，32（7）：617-625.

［7］Ouyang Y L，Azcona-Olivera J I，Murtha J，et al.Vomitoxin-mediated IL-2，IL-4，and IL-5 superinduction in murine CD4+T cells stimulated with phorbol ester and calcium ionophore:relation to kinetics of proliferation［J］.Toxicology and Applied Pharmacology，1996，138（2）：324-334.

［8］Kouadio J H，Mobio T A，Baudrimont I，et al.Comparative study of cytotoxicity and oxidative stress induced by deoxynivalenol，zearalenone or fumonisin B1 in human intestinal cell line Caco-2［J］.Toxicology，2005，213（1-2）：56-65.

［9］Chen F，Ma Y L，Xue C Y，et al.The combination of deoxynivalenol and zearalenone at permitted feed concentrations causes serious physiological effects in young pigs［J］.Journal of Veterinary Science，2008，9（1）：39-44.

TheEffect of Intraperitoneal Injection of Deoxynivalenol on Biochemical and ImmuneIndexes of Plasma in Broiler Chickens

HUANG Kai，ZHU Feng-hua，SONG Ming-ming，XU Dan，WANG He，ZHANG Rui-xing，ZHU Lian-qin
（College of Animal Science and Technology，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China）

This trial was conducted to determine the effect of intraperitoneal injection of the deoxynivalenol on broiler chickens.A total of 32 male broiler chicks were randomly divided into 4 treatments with 8 broiler chickens per treatment.Treatment one was the control group injected with normal saline.The broiler chickens in treatment two to four were intraperitoneally injected with 1 mL deoxynivalenol containing deoxynivalenol 10，50 and 100 μg/mL，respectively，once a day for 5 weeks.The results showed that the concentration of IL-4，IL-6，IgA and IgM，the antibody level of NDV and IBDV，the activity of GSH-Px，and the level of T-AOC in serum in the broiler chickens intraperitoneally injected with 1 mL the deoxynivalenol containing the deoxynivalenol 50 or 100 μg/mL were significantly lower than that in the control group（P＜0.05）.In broiler chickens injected with 1 mL the deoxynivalenol containing the deoxynivalenol 10～100 μg/mL，the activity of AST in serum was significantly higher than that in the control group（P＜0.05）.In broiler chickens injected with 1 mL the deoxynivalenol containing the deoxynivalenol 100 μg/mL，LTR of spleen and peripheral blood was significantly lower than other treatments（P＜0.05）.In conclusion，the deoxynivalenol has significantoxidative damage and immunotoxicity to broilers in a dose-dependent manner.

Deoxynivalenol；Intraperitoneal injection；Broiler chicken；Oxidative stress；Immunity

ZHU Lian-qin

S858.31

A

0529-6005（2016）04-0033-03

2014-10-14

山東省現代農業產業技術體系家禽產業創新團隊項目（SDAIT-13-011-07）；青島科技局項目（12-1-2-32-nsh）

黃凱（1988-），男，碩士，研究方向為動物營養代謝病與中毒病，E-mail：945044149@qq.com

朱連勤，E-mail：lqzhu@qau.edu.cn