PRRSV變異株ORF5全基因的可溶性表達與重組蛋白的純化

任穎超，黃　娟，單　虎

（青島農業大學 山東省高校預防獸醫學重點實驗室，山東 青島266109）

PRRSV變異株ORF5全基因的可溶性表達與重組蛋白的純化

任穎超，黃娟，單虎

（青島農業大學 山東省高校預防獸醫學重點實驗室，山東 青島266109）

為了獲得豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）變異株可溶性糖基化囊膜蛋白（GP5），從pMD18-T-ORF5（V）重組質粒中PCR擴增得到PRRSV變異株LX13（1）結構蛋白ORF5全基因編碼區，并克隆至原核表達載體pCold TF DNA上，得到重組表達質粒pCold-TF-GP5（V），轉化大腸埃希菌BL21中誘導表達，并通過SDS-PAGE和Western Blot鑒定分析。結果表明，目的基因插入位置和閱讀框正確，成功表達的融合蛋白分子量約為75.2 ku，并以可溶性蛋白的形式存在，表達量約占菌體總蛋白含量的22.26%。該融合蛋白能與鼠抗His標簽單克隆抗體發生特異性反應，說明重組蛋白具有反應原性。該可溶性重組蛋白的獲得為研究PRRSV變異株GP5蛋白的抗原性奠定了基礎。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒；變異株；ORF5基因；可溶性原核表達

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）可引起妊娠母豬繁殖障礙、仔豬的呼吸道癥狀甚至死亡。該病在1987年首發于美國，并很快蔓延至世界各地。郭寶清等于1996年在國內首次分離到該病毒。之后，隨著PRRSV的遺傳和變異，我國在2006年暴發了以仔豬高死亡率為特征的高致病性藍耳?。?］，使我國養豬業受到重創。

PRRSV的主要結構蛋白GP5是由ORF5編碼的糖基化囊膜蛋白，變異性較強，具有誘導細胞凋亡的活性，并可能參與病毒入侵宿主細胞的過程［2］。GP5蛋白被認為是PRRSV免疫保護的主要蛋白［3］。高致病性PRRSV變異株和經典株在GP5蛋白基因上發生較大的變異，其核苷酸變異性在5%以上［4］，這種變異對其抗原性的影響還未見報道。

本研究采用一種高效原核表達載體pCold TF DNA獲得高致病性PRRSV變異株重組GP5表達質粒，在E.coli BL21中獲得可溶性表達產物，并對表達的重組融合蛋白進行定性分析，為進一步比較高致病性PRRSV變異株和經典株GP5蛋白抗原性差異奠定了基礎。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種與載體大腸埃希菌（E.coli）DH5α和BL21、質粒pCold TF DNA，購自TaKaRa公司，含PRRSV變異株LX13（1）株ORF5基因的質粒pMDl8-T-ORF5（V）由筆者構建、保存。

1.1.2試劑限制性內切酶（EcoR I、Kpn I），T4 DNA連接酶，HRP標記的抗His標簽鼠單抗，購自北京康為世紀生物科技有限公司；His Trap HP親和層析柱，購自GE Healthcare公司。

1.2方法

1.2.1重組原核表達載體pCold-TF-GP5（V）的構建及鑒定根據LX13（1）核苷酸序列，應用Primer5.0軟件設計一對特異性引物，P1：5′-GGGGTACCATGTTGGGGAAGTGCTTG-3′；P2：5′-GGAATTCCTAGAGACGACCCCATAG-3′，劃線部分為EcoR I和Kpn I酶切位點。以pMDl8-T-ORF5（V）為模板進行PCR擴增，EcoR I和Kpn I雙酶切PCR產物純化后，連接至pCold TF DNA，并轉化DH5α。鑒定后的陽性質粒由北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

1.2.2TF-GP5（V）蛋白的誘導表達及可溶性分析將pCold-TF-GP5（V）轉化BL21菌后，按1∶100比例接種于含有50 μg/mL Amp的LB液體培養基中，37℃振蕩，當培養液的D600nm值為0.4～0.5時，移至15℃放置30 min。添加IPTG至終濃度為0.8 mmol/L，15℃條件下培養24 h。誘導菌體、誘導菌體超聲波破碎后的上清和沉淀分別取樣進行SDS-PAGE電泳。

1.2.3TF-GP5（V）蛋白的純化及Western Blot鑒定將誘導的菌體經超聲波破碎后離心，取上清經鎳柱純化。將表達產物濕轉轉至PVDF膜上，5%BSA中過夜封閉；使用HRP標記的抗His標簽鼠單抗孵育后，置于DAB底物顯色液中顯色。

2　結果與分析

2.1重組原核表達載體pCold-TF-GP5（V）的構建及鑒定擴增產物在1.0%瓊脂糖凝膠電泳上出現與預期片段大?。?18 bp）一致的條帶（圖1）。重組質粒經EcoR I、Kpn I雙酶切，在5 769 bp（pCold TF DNA載體片段）和618 bp（目的片段）處出現條帶；以重組質粒為模板進行PCR鑒定得到618 bp左右的片段（圖2），均與預期相符。將測序正確的重組質粒命名為pCold-TF-GP5（V）。

2.2TF-GP5（V）蛋白的誘導表達及可溶性分析

圖1　PCR擴增ORF5基因

圖2　重組質粒pCold-TF-GP5（V）的鑒定

pCold-TF-GP5（V）重組轉化菌經IPTG于15℃誘導24 h后，在75.2 ku附近出現一蛋白條帶，與預期大小一致。經超聲波破碎后發現，重組蛋白主要存在上清中，沉淀中幾乎沒有，為可溶性表達。而空載體pCold TF DNA轉化菌經誘導可表達52 ku的TF蛋白（圖3）。

圖3　SDS-PAGE鑒定目的蛋白的表達

2.3TF-GP5（V）蛋白的純化及Western Blot分析

經純化獲得較純的75.2 ku重組蛋白（圖4）。Western Blot結果顯示，融合蛋白在75.2 ku大小附近出現一條清晰的反應條帶（圖5），表明融合蛋白能與抗His標簽鼠單克隆抗體發生特異性反應，具有良好的反應原性。

圖4　重組蛋白的純化

圖5　Western Blot鑒定GP5融合蛋白的反應原性

3　討論

在我國PRRSV尤其是高致病性PRRSV變異株始終是嚴重威脅養豬業的最重要病原之一。免疫接種是目前防制PRRS的主要措施，但PRRS滅活疫苗保護率低，活疫苗不能免疫妊娠母豬和種豬，不利于該病的徹底防制［5］。PRRSV的高變異性也給疫苗免疫帶來新的挑戰。GP5蛋白是PRRSV的重要結構蛋白之一，能起到參與體液免疫和細胞免疫的作用，并具有較高的免疫原性和中和活性，是研究PRRSV免疫保護的熱點蛋白［6］。因此，研究PRRSV高致病性變異株和經典株GP5蛋白基因的變異性和蛋白的抗原性在疫苗制備中意義重大。

GP5蛋白是糖基化的囊膜蛋白，含有高度保守的N-糖基化位點和高疏水區的信號肽序列，因而在大腸埃希菌等表達系統中表達一直不夠理想，很難表達出完整的GP5蛋白［7］。以往的研究中，多通過去除基因N端的信號肽序列或跨膜區或通過密碼子優化等手段以期獲得GP5蛋白的表達，盡管有些能獲得高效表達，但也多以包涵體形式存在［8-9］。后期還需蛋白質復性才能獲得可溶性蛋白，而復性過程十分復雜，且效率往往與特定蛋白質的性質有關，選擇何種方法也需要反復試驗，操作繁瑣［10］。

pCold TF DNA帶有cspA（冷休克蛋白A）啟動子及相關元件，使得菌體在低溫15℃環境下培養時，目的蛋白質的產量得到了提高，此外，由于pCold TF DNA帶有可溶性標簽Trigger Factor（TF），能提高目的蛋白質的可溶性［11］。因此，本研究選用pCold TF DNA來表達融合蛋白，SDS-PAGE和Western Blot分析表明，在大腸桿菌BL21中完整的PRRSV GP5蛋白獲得了高效可溶性表達，且具有良好的反應原性。為下一步研究PRRSV高致病性變異株GP5蛋白的免疫原性及與經典株GP5蛋白的交叉反應性奠定基礎。

［1］童光志，周艷君，郝曉芳，等.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分離鑒定及其分子流行病學分析［J］.中國預防獸醫學報，2007，29（5）：323-326.

［2］Delputte P L，Vanderheijden N，Nauwynck H J，et al.Involvement of the matrix protein in attachment of porcine reproductive and respiratory syndrome virus to a heparinlike receptor on porcine alveolar macrophages［J］.J Virol，2002，76（9）：4312-4320.

［3］Zheng Q S，Chen D S，Li P，et al.Co-expressing GP5 and M proteins under different promoters in recombinant modified vaccinia virus Ankara（rMVA）-based vaccine vector enhanced the humoral and cellular immune responses of porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）［J］.Virus Genes，2007，35：585-595.

［4］安同慶，田志軍，肖燕，等.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株主要囊膜糖蛋白GP5的遺傳變異分析［J］.中國預防獸醫學報，2008，30（11）：851-855.

［5］冷超糧.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白B表位誘導中和抗體能力的研究［J］.中國預防獸醫學報，2011，33（4）：297-300.

［6］李欣賢，張曉丹，劉晶晶，等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒糖基化囊膜蛋白5原核表達載體的構建及免疫原性分析［J］.中國畜牧獸醫，2014，41（4）：89-94.

［7］尹國友，孫婕，黃保續.豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF5基因的克隆與原核表達［J］.動物醫學進展，2009，30（12）：63-66.

［8］劉岳，肖一紅，崔然，等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白分段表達及其生物學功能的鑒定［J］.中國預防獸醫學報，2011，33（4）：257-260.

［9］孫文超，任靜強，溫樹波，等.應用不同表達載體表達歐洲型PRRSV ORF5蛋白的研究［J］.中國病原生物學雜志，2013，8（11）：961-965.

［10］谷紅，楊漢春，郭鑫，等.PRRSV BJ-4株ORF5基因的原核表達與重組蛋白的純化［J］.畜牧獸醫學報，2004，35（1）：64-69.

［11］楊李，周鷹，王運剛，等.粉塵螨變應原第1組分原核表達質粒pCold-TF-Derf1構建及鑒定［J］.中國媒介生物學及控制雜志，2012，23（4）：289-291.

SolubleProkaryotic Expression of ORF5 Geneof PRRSV Variant and Purification of Recombinant Protein

REN Ying-chao，HUANG Juan，SHAN Hu
（Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine in Universities of Shandong，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China）

The coding region of ORF5 gene from PRRSV variant was successfully amplified from pMD18-T-ORF5（V）by PCR，and was cloned into the prokaryotic expression vector pCold TF.The recombinant plasmid pCold-TF-GP5（V）was transformed into E.coli BL21 and the induced protein was confired by SDS-PAGE and Western blot.The results showed the target gene was inserted into the exact location and the reading frame was correct.An 75.2 ku soluble protein was successfully induced with a content of 22.26%of total bacterial protein.The recombinant protein showed good reaction with the His-tag monoclonal antibody. Our results contribute to the antigenicity study of glycosylated envelope protein 5（GP5）from PRRSV variant.

Porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）；Variant；ORF5 gene；Soluble prokaryotic expression

HUANG Juan

S852.65+1

A

0529-6005（2016）04-0030-03

2014-11-28

國家科技基礎性工作專項（2012FY111000）；山東省現代農業產業技術體系生豬產業創新團隊建設；青島農業大學高層次人才科研基金（6630719）

任穎超（1989-），女，碩士，研究方向為獸醫傳染病學與生物制品，E-mail：sdzbryc@163.com

，黃娟，E-mail：happyhj888@163.com