雞小腸上皮細胞分離培養及NLRP3在該細胞中的表達

陶志云，朱春紅，徐文娟，姬改革，李慧芳

（江蘇省家禽科學研究所，江蘇 揚州 225125）

雞小腸上皮細胞分離培養及NLRP3在該細胞中的表達

陶志云，朱春紅，徐文娟，姬改革，李慧芳

（江蘇省家禽科學研究所，江蘇 揚州 225125）

為了探明NLRP3在雞小腸上皮細胞中表達情況，為雞的NLRP3基因在小腸細胞中的功能研究奠定基礎。采用18胚齡的雞胚，分離培養雞的小腸上皮細胞（intestinal epithelial cells，IEC）；采用免疫細胞化學（immunocytochemistry，ICC）和反轉錄PCR（RT-PCR）方法，檢測NLRP3基因在雞小腸上皮細胞中的表達。結果表明：分離培養出活性較強的IEC；ICC檢測顯示獲得的小腸上皮細胞表面NLRP3抗原陽性，RT-PCR法可擴增出520 bp的目的片段。表明成功分離培養出雞小腸上皮細胞，并證明雞NLRP3在雞小腸上皮細胞中表達。

雞；小腸上皮細胞；NLRP3

NLRP3是近年發現的胞質型模式識別受體—NOD樣受體家族的一員，研究表明，其能識別多種微生物，在機體固有免疫反應和疾病發生中具有重要作用。NLRP3炎性小體與多種感染性和免疫性疾病相關。近年研究表明，NLRP3在炎癥性腸病（IBD）的發生過程中也發揮重要作用［1-3］。但這些研究對象都是哺乳動物，未見在禽類中的研究報道。雞NLRP3基因能否識別雞腸道微生物，發揮抗病作用尚不知曉。研究表明，NLRP3在嗜中性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞、樹突狀細胞、成骨細胞、上皮細胞中均有表達［4］。但是否在雞小腸上皮細胞中表達尚不清楚。因此，本文分離培養了雞小腸上皮細胞，并鑒定NLRP3在小腸細胞中的表達情況，為NLRP3在禽類的研究奠定基礎。

1　材料與方法

1.1試驗材料試驗選擇18胚齡的雞胚，雞胚來源于國家級地方雞種基因庫（江蘇）。

1.2主要試劑和儀器DMEM（Coning），DMEM/ F12（Hyclone），胰蛋白酶（Amresco），I型膠原酶（Solarbio），胎牛血清（Hyclone），CK18兔多克隆抗體（BBI），NLRP3兔多克隆抗體（BBI），猴抗兔二抗（BBI），TRNzol-A+總RNA提取試劑（Tiangen）、SYBR Green SuperReal PreMix（Tiangen）、Quant cDNA第一鏈合成試劑盒（Tiangen）。

二氧化碳培養箱（Memmert），生物安全柜（蘇凈安泰）；熒光倒置顯微鏡（Nikon）；酶標儀（Rayto），PCR儀（Eppendorf）；凝膠成像系統（Tanon）；高速冷凍離心機（Eppendorf）。

1.3試驗方法

1.3.1雞小腸上皮細胞的分離培養孵化至18胚齡的雞胚去殼，用無菌鑷子挑出胚胎，置于加入青、鏈霉素的PBS的燒杯中。在生物安全柜中，于無菌培養皿中小心剝離小腸，去除腸系膜，用PBS將小腸內腔沖洗干凈，剪碎成1 mm3碎片，用DMEM重懸，按1∶1的比例加入適量0.1%Ⅰ型膠原酶消化30～40 min，加入適量FBS終止消化，反復吹打多次，然后將消化液先用50目尼龍濾膜過濾，收集濾液去除未消化完全的組織，再用300目的尼龍膜過濾去除單細胞，收集尼龍膜上的小腸隱窩細胞團于15 mL離心管中，1 000 r/min離心5 min，將細胞沉淀懸浮于培養液中，調整適當密度接種于6孔培養板或96孔板中，37℃、5%CO2培養箱內培養。

1.3.2雞小腸上皮細胞形態學檢查在倒置顯微鏡下觀察細胞的生長狀態和形態特征。

1.3.3細胞生長曲線繪制采用MTT法測定細胞的活性和生長。將小腸隱窩細胞團按1×105個/mL的密度接種于96孔細胞培養板中，分別在培養的1 d到10 d用酶聯免疫測定儀測定細胞在492 nm處的光吸收值（OD）值，每天設10個復孔。

1.3.4免疫細胞化學法鑒定小腸上皮細胞和檢測NLRP3的表達本試驗針對上皮組織的特異性抗原成分即細胞角蛋白（CK18）進行小腸上皮細胞的鑒定。在細胞培養至6 d時，PBS洗2～3遍；用4%多聚甲醛室溫下固定30 min；0.5%Triton-X100通透處理15 min，PBS洗2～3次；5%BSA封閉20 min；添加適當1抗（1∶50），室溫1～2 h，PBS洗 2～3次；陰性對照添加等量PBS；加入生物素化猴抗兔IgG，室溫1 h，PBS洗2～3次；熒光顯微鏡下觀察。NLRP3在小腸上皮細胞中的表達檢測方法同CK18鑒定小腸上皮細胞。

1.3.5RT-PCR法檢測NLRP3的表達取小腸上皮細胞的總RNA，反逆轉錄成cDNA。根據Gen-Bank中的雞NLRP3序列（KJ470775.1），采用Primer Premier 5.0軟件設計引物，上游引物序列為5′-CGGCATCTGGAAGCACAAGG-3′；下游引物序列為5′-GAAACTGCCCAACACGCTCT-3′。目的片段長度520 bp，PCR反應體系總體積為20 μL，退火溫度60℃，72℃延伸10 min，35個循環。擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2　結果與分析

2.1雞小腸上皮細胞的分離培養及生長情況

由圖1不同時間的小腸上皮細胞圖1和圖2的細胞生長曲線圖可見，兩者結果一致，即分離培養的小腸隱窩細胞團在24 h開始生長，即貼壁并在周圍輻射出少量的小腸上皮細胞，為多角形或蝌蚪形，在4～6 d，細胞快速增殖，分裂旺盛，分布均勻，數量顯著增多，形成集落，呈單層“鋪路石”狀生長，培養7～8 d，細胞分裂開始減少，表現為細胞數量相對穩定。培養9 d以后，細胞體積發生膨大，細胞量出現減少。

2.2免疫細胞化學法鑒定雞小腸上皮細胞本文采用上皮組織的特異性抗原成分細胞角蛋白CK18的特異性抗體-兔CK18多克隆抗體，對小腸上皮細胞進行免疫細胞化學染色，再用FITC標記的抗兔二抗與之結合，陽性細胞在熒光顯微鏡下可見明顯綠色熒光（圖3，A2）。對照組未加CK18抗體，因此熒光顯微鏡下未見熒光（圖3，A1）。

圖1　培養不同時間的小腸上皮細胞

圖2　雞小腸上皮細胞生長曲線

2.3雞小腸上皮細胞中NLRP3的表達鑒定采用兔的NLRP3多克隆一抗和帶FITC熒光標記的二抗對雞小腸上皮細胞進行免疫組化染色后，可見明顯的綠色熒光（圖4A），陰性對照組無綠色熒光（圖4B）。采用反轉錄PCR法檢測NLRP3基因在雞小腸上皮細胞中的表達情況，獲得條帶單一、明亮的目的片段，經測序為520 bp，陰性對照管未加cDNA模板，未見目的條帶（圖5）。

圖3　CK18雞小腸上皮細胞鑒定

圖4　NLRP3在小腸上皮細胞中的免疫細胞化學鑒定

圖5　雞NLRP3基因的部分cDNA片段凝膠電泳

3　討論

3.1雞小腸上皮細胞的分離培養不同的消化液對小腸上皮細胞分離效果不同，已有研究表明，采用膠原酶I消化可獲得大量細胞團［5-6］。本試驗采用18日齡的雞胚，0.1%I型膠原酶消化30～40 min，在消化過程中用吸管輕輕的反復吹打組織塊以利于細胞分離，也獲得了大量腸隱窩細胞團，分離效果較好。酶消化后的細胞懸液中混有大量的單個細胞，需要進一步進行純化處理。小腸隱窩細胞團的純化方法很多，包括機械刮除法、相差消化-相差貼壁法等［7］。這兩種方法均可以獲得較純的小腸上皮細胞，但比較費時和費力。Grossmann等（2003）報道了一種快速純化IEC的方法［8］。本文在此方法的基礎上進行了改進，經鑒定獲得了純度較高的小腸上皮細胞。對分離、純化的細胞進行培養后的形態觀察和細胞生長曲線繪制，結果表明，細胞在1～2 d為貼壁和緩慢生長期，3 d后生長加速并進入快速生長期，8 d后由于細胞密度較高彼此擠壓生長受到抑制，增殖下降。

3.2NLRP3在小腸上皮細胞中的表達研究表明，小腸上皮細胞感染腸炎耶爾森病原體過程中，NLRP3炎性小體激活［9］，表明NLRP3在識別病原菌過程中具有重要作用。我們之前的研究報道了NLRP3基因在雞不同組織中的表達情況［10］，表明NLRP3在小腸中有表達，但其在腸道識別病原菌和腸道疾病的發生發展過程中的作用尚不清楚。因此，體外分離培養小腸上皮細胞并研究NLRP3在小腸上皮細胞中的功能具有重要意義。本試驗在蛋白水平和轉錄水平鑒定了NLRP3在小腸上皮細胞中表達，這為以后NLRP3在雞小腸上皮細胞中的功能研究奠定了基礎。

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［3］De la Fuente M，Franchi L，Araya D，et al.Escherichia coli isolates from inflammatory bowel diseases patients survive in macrophages and activate NLRP3 inflammasome［J］.Int J Med Microbiol，2014，304（3-4）：384-392.

［4］馮靜靜.NLRP3炎性小體在炎癥性腸病中的研究進展［J］.胃腸病學，2011，16（6）：370-372.

［5］馬玉龍，許梓榮，郭彤，等.雞腸上皮細胞的分離及原代培養方法［J］.中國獸醫學報，2007，2（1）：74-80.

［6］洪智敏，賈永杰，瞿明仁，等.雞胚小腸上皮細胞的分離及原代培養研究［J］.江西農業大學學報，2011，33（6）：1164-1170

［7］李艷，彭春燕，梁榕旺，等.雞小腸上皮細胞的分離培養與鑒定［J］.中國畜牧獸醫，2011，38（2）：68-72.

［8］Grossmann J，Walther K，Attinger M，et al.Progression on isolation and short-term ex-vivo culture of highly purified non-apoptotic human intestinal epithelial cells（IEC）［J］.KJCB，2003，82：262-270.

［9］Thinwa J，Segovia J A，Bose S，et al.Integrin-mediated first signal for inflammasome activation in intestinal epithelial cells［J］.J Immunol，2014，193（3）：1373-1382.

［10］陶志云，施祖灝，朱春紅，等.清遠麻雞NLRP3基因部分cDNA序列克隆及組織表達差異研究［J］.江蘇農業學報，2014，30（1）：140-143.

Isolation and cultureof chicken intestinal epithelial cells and theexpression of NLRP3 in thesecells

TAO Zhi-yun，ZHU Chun-hong，XU Wen-juan，JI Gai-ge，LI Hui-fang
（Jiangsu Institute of Poultry Sciences，Yangzhou 225125，China）

The aim of this study is to ascertain the expression of NLRP3 in intestinal epithelial cells（IECs）of chicken，and lay the foundation for the functional studies of chicken NLRP3 gene in IECs.Intestinal epithelial cells were isolated and cultured from chicken embryo at 18 days.The expression of chicken NLRP3 was detected by immunocytochemistry（ICC）and reverse transcription PCR（RT-PCR）method.The results showed that chicken IEC grew very well.The surface antigen of NLRP3 was positive by ICC，and the 520 bp fragments of NLRP3 gene was obtained by RT-PCR length.Chicken IECs were isolated and cultured successfully.These results indicate that chicken NLRP3 gene exists in chicken IECs.

chicken；intestinal epithelial cells；NLRP3

LI Hui-fang

S858.31

A

0529-6005（2016）04-0022-03

2014-10-14

國家自然科學基金青年基金項目（31101795，3110 1833）；現代農業技術領域863計劃（2011AA100301）；現代農業產業技術體系（CARS-42-G03）

陶志云（1979-），女，助理研究員，博士生，主要從事動物免疫學及動物遺傳育種方面的研究，E-mail：zhiyun2@126. com

李慧芳，E-mail：lhfxf-002@aliyun.com.cn