酶法輔助回流提取荷葉中荷葉堿的工藝研究

寧　　娜，韓建軍，胡宇莉，鄒宗堯，郁建生

（1.銅仁職業技術學院藥學院，貴州 銅仁 554300；2.貴州省中獸藥工程研究中心，貴州 銅仁 554300；3.重慶市動物疫病預防控制中心，重慶 渝北 401120；4.西南大學藥學院，重慶 北培 400715）

酶法輔助回流提取荷葉中荷葉堿的工藝研究

寧娜1，2，韓建軍1，2，胡宇莉3，4，鄒宗堯4，郁建生1，2

（1.銅仁職業技術學院藥學院，貴州 銅仁 554300；2.貴州省中獸藥工程研究中心，貴州 銅仁 554300；3.重慶市動物疫病預防控制中心，重慶 渝北 401120；4.西南大學藥學院，重慶 北培 400715）

為了優化纖維素酶輔助乙醇回流提取荷葉中荷葉堿的工藝，在單因素試驗的基礎上，通過正交試驗設計考察了提取荷葉堿過程中的酶解pH值、酶解溫度、纖維素酶用量及酶解時間對荷葉堿提取率的影響，得出優化的酶解輔助提取工藝為：酶解pH值4.5、酶解溫度45℃、纖維素酶用量1.5 mg/g、酶解時間50 min，在此條件下荷葉堿提取率達到0.536%。該提取工藝合理、穩定、可行，為進一步工業化生產提供理論依據。

荷葉；荷葉堿；纖維素酶；回流；提取

荷葉為睡蓮科植物蓮（Nelumbo nucifera Gaertn.）的干燥葉，其性苦味平，具有消暑化濕、涼血止血之功效，主治暑濕泄瀉、脾虛泄瀉、子宮出血等癥［1］。荷葉含有生物堿、黃酮、甾醇等成分，其中荷葉堿是荷葉藥材質量控制的指標成分［1-2］。

目前已報道的荷葉中荷葉堿的提取主要有回流法［3］、浸提法［4］、超高壓［5］等。生物酶解技術是一種新興的提取方法，該方法是通過生物酶的酶解作用可使植物細胞壁疏松、破裂，促進有效成分的溶出，具有收率高、反應條件溫和且易于控制等特點［6-7］。因此，越來越多的研究將生物酶解技術與回流法聯合起來應用于植物有效成分的提取中，具有提取率高、提取時間短、有機溶劑消耗少等優點［8-9］。目前將生物酶解技術聯合回流法應用于荷葉中荷葉堿的提取尚未見報道。本文在常規回流法提取荷葉中荷葉堿的基礎上加入酶解預處理步驟，并通過正交試驗設計優化酶解輔助提取工藝，為荷葉中荷葉堿的開發利用提供技術支撐。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑Agilent 1100型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；RE-2000A旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；pHS-3C精密pH計（上海雷磁儀器廠）；FW100型高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；水為重蒸水，乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純；纖維素酶（酶活力：22 000 U/g）（寧夏和氏璧生物技術有限公司）；荷葉堿對照品（純度：99.9%）（中國食品藥品檢定研究院）。

1.2藥材荷葉，產地為江西，購自江西樟樹中藥材市場，由本院梁玉勇教授鑒定為睡蓮科植物蓮Nelumbo nucifera Gaertn.的干燥葉。

1.3試驗方法

1.3.1荷葉堿的HPLC測定參照《中華人民共和國獸藥典》［1］，具體色譜條件為：Kromasil-C18柱（4.6 mm×150.0 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水-三乙胺-冰醋酸（27∶70.6∶1.6∶0.78）；流速：1.0 mL/ min；柱溫：25℃；檢測波長：270 nm；進樣量：10 μL。該色譜條件下理論塔板數以荷葉堿峰計算不低于2 000。該色譜條件下測定荷葉堿標準品及荷葉藥材得到的色譜圖見圖1。峰面積Y與荷葉堿濃度X（μg/mL）之間的回歸方程為：Y= 513496.20X+89844.46，R=0.9997，線性范圍為：5.4～172.8 μg/mL。經測定，本試驗所用荷葉藥材中荷葉堿含量為0.563%。

1.3.2荷葉中荷葉堿的提取工藝流程酶法輔助乙醇回流提取荷葉中荷葉堿的提取工藝流程如下：荷葉→干燥、粉碎成粗粉（過40目篩）→纖維素酶解→回流提取→合并提取液→減壓回收溶劑→浸膏→真空干燥→測定荷葉堿含量，并計算荷葉堿收率。通過參考文獻［10］及結合預試驗結果，確定回流提取荷葉堿的工藝條件為：用8倍量的60%乙醇提取2次，每次60 min。

圖1　荷葉堿標準品（A）和荷葉藥材（B）的高效液相色譜圖

1.3.3荷葉堿提取率的計算取0.3 g荷葉乙醇浸膏置于10 mL容量瓶中，并用甲醇超聲溶解后，用甲醇定容至刻度，搖勻，經0.45 μm濾膜過濾，取續濾液10 μL注入液相色譜儀，測定峰面積，計算荷葉堿含量，并計算荷葉堿提取率。荷葉堿提取率按如下公式進行計算：

荷葉堿提取率（%）=［提取得到的荷葉堿量（g）/荷葉藥材中荷葉堿含量（g）］×100%。

1.3.4酶輔助回流提取的單素試驗分別選取酶解pH值、酶解溫度、纖維素酶用量和酶解時間進行單因素試驗。試驗中，除所考察的因素外，其他參數分別為：酶解pH值4.5、酶解溫度45℃、纖維素酶用量1.5 mg/g、酶解時間40 min。

1.3.5酶輔助回流提取的正交試驗根據單因素試驗結果確定正式試驗的因素及水平。

2　結果與分析

2.1單因素試驗

2.1.1酶解pH值稱取荷葉堿粉末5份（10 g），加入100 mL蒸餾水，酶解pH值分別為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，按照1.3.2提取荷葉堿，并計算荷葉堿提取率。試驗結果見圖2。

圖2　酶解pH值對荷葉堿提取率的影響

由圖2可知，荷葉堿提取率隨著酶解pH值的增大而增大，在酶解pH值為4.5時達到最大，隨著酶解pH值進一步增大，荷葉堿提取率有下降趨勢，這是由于酶解pH值高于或低于纖維素酶的最適pH值均會影響纖維素酶的催化活力，從而影響荷葉堿的提取效率。因此選擇4.0、4.5、5.0作為正交試驗中酶解pH值因素的3個試驗水平。

2.1.2酶解溫度稱取荷葉堿粉末5份（10 g），加入100 mL蒸餾水，酶解溫度分別為35℃、40℃、45℃、50℃、55℃，按照1.3.2提取荷葉堿，并計算荷葉堿提取率。試驗結果見圖3。

圖3　酶解溫度對荷葉堿提取率的影響

由圖3可知，荷葉堿提取率隨著酶解溫度的升高而增大，在酶解溫度為45℃時達到最大，隨著酶解溫度進一步升高，荷葉堿提取率有下降趨勢，這是由于低于纖維素酶的最適溫度時，溫度升高可促進纖維素酶酶活力的增強，而高于纖維素酶的最適溫度時可引起酶蛋白的變性，從而降低纖維素酶的催化活力。因此選擇40℃、45℃、50℃作為正交試驗中酶解溫度因素的3個試驗水平。

2.1.3纖維素酶用量稱取荷葉堿粉末5份（10 g），加入100 mL蒸餾水，纖維素酶用量分別為0.5 mg/g、1.0 mg/g、1.5 mg/g、2.0 mg/g、2.5 mg/g，按照1.3.2提取荷葉堿，并計算荷葉堿提取率。試驗結果見圖4。

圖4　纖維素酶用量對荷葉堿提取率的影響

由圖4可知，荷葉堿提取率隨著纖維素酶用量的增加而增大，在纖維素酶用量為1.5 mg/g時達到最大，隨著纖維素酶用量進一步增加，荷葉堿提取率有下降趨勢。這是由于隨著纖維素酶用量的增加，促進了纖維素酶對荷葉藥材植物細胞壁的降解，增加了荷葉堿的溶出，當酶用量超過1.5 mg/g之后，酶與底物的作用點已經達到飽和，繼續增加纖維素酶用量，使纖維素酶過于擁擠而包裹住荷葉藥材顆粒，從而阻礙荷葉堿的溶出。因此選擇1.0 mg/g、1.5 mg/g、2.0 mg/g作為正交試驗中纖維素酶用量因素的3個試驗水平。

2.1.4酶解時間稱取荷葉堿粉末5份（10 g），加入100 mL蒸餾水，酶解時間分別為20、30、40、50、60 min，按照1.3.2提取荷葉堿，并計算荷葉堿提取率。試驗結果見圖5。

圖5　　酶解時間對荷葉堿提取率的影響

由圖5可知，荷葉堿提取率隨著酶解時間延長而明顯升高，當酶解時間超過40 min后，荷葉堿提取率增加的趨勢有所平緩。因此選擇30 min、40 min、50 min作為正交試驗中酶解時間因素的3個試驗水平。

2.2正交試驗根據單因素試驗結果，以荷葉堿提取率為指標，選擇酶解pH值、酶解溫度、纖維素酶用量、酶解時間4個因素進行正交試驗，對荷葉堿提取工藝進行優化。按照L9（34）正交表進行試驗，試驗因素水平和試驗結果分別見表1和表2。

表1　因素與水平

由表2的極差分析結果可知，各因素對荷葉堿提取率影響的順序為：酶解pH值＞酶解溫度＞纖維素酶用量＞酶解時間。優化得到的酶解輔助提取條件為A2B2C2D3，即酶解pH值為4.5、酶解溫度為45℃、纖維素酶用量為1.5 mg/g、酶解時間為50 min。在此條件下，荷葉堿的提取率為0.536%。

3　結論

本研究采用酶法輔助回流法提取荷葉中荷葉堿，通過單因素及正交試驗，最終確定最佳酶解輔助提取條件為：酶解pH值為4.5、酶解溫度為45℃、纖維素酶用量為1.5 mg/g、酶解時間為50min。荷葉藥材在該條件下酶解后，再進行常規回流提取（用8倍量60%乙醇提取2次，每次提取60 min），荷葉堿的提取率可達0.536%。優化的工藝穩定可行，較常規乙醇回流提取法［10-11］的提取效率高、提取時間短、有機溶劑消耗量少。該提取方法對設備無特殊要求、試驗條件容易控制、溶劑消耗量少、安全環保，適合工業化大生產。

表2　正交試驗表及結果

［1］中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典（二部）［M］.北京：中國農業出版社，2010：380.

［2］趙小亮，王智民，馬小軍，等.荷葉化學成分研究［J］.中國中藥雜志，2013，38（5）：703-708.

［3］王玉霞，劉斌，姜艷艷.荷葉生物堿提取純化工藝研究［J］.北京中醫藥大學學報，2013，36（9）：622-626.

［4］朱曉月，劉虹，郝彧，等.荷葉中生物堿提取及純化工藝研究［J］.中國實驗方劑學雜志，2010，16（9）：22-24.

［5］Liu F，Zhu R H，Lin X J，et al.Cloud point extraction and preconcentration of four alkaloids in Nelumbo nucifera leaves by ultrahigh pressure-assisted extraction［J］.Separation Science and Technology，2014，49（7）：981-987.

［6］王賽君，伍振峰，楊明，等.中藥提取新技術及其在國內的轉化應用研究［J］.中國中藥雜志，2014，39（8）：1360-1367.

［7］宋成英.酶解技術在中藥提取中的應用研究［J］.時珍國醫國藥，2013，24（8）：1934-1935.

［8］李會端.酶解法提取紫藤總黃酮及自由基清除活性研究［J］.河南師范大學學報（自然科學版），2014，42（3）：79-84.

［9］吳衛，唐振祥，李素珍.酶解法輔助提取鉤藤中鉤藤堿的工藝優選［J］.中國實驗方劑學雜志，2015，21（10）：23-25.

［10］王國華，張保獻，聶其霞，等.星點設計-效應面法優選荷葉中荷葉堿與荷葉黃酮的提取工藝［J］.中國中藥雜志，2008，33（20）：2332-2335.

［11］王玉霞，劉斌，姜艷艷.荷葉生物堿提取純化工藝研究［J］.北京中醫藥大學學報，2013，36（9）：622-626.

Study on Enzyme-Assited Reflux Extraction for NuciferinefromNelumbo nuciferaLeaves

NING Na1，2，HAN Jian-jun1，2，HU Yu-li3，4，ZOU Zong-yao4，YU Jian-sheng1，2
（1.Department of Phamrmacy，Tongren Vocational and Technical College，Tongren 554300，China；2.Engineering Reserch Center of Vetrinary Traditonal Chinese Medicine in Guizhou，Tongren 554300，China；3.Animal Disease Prevention and Control Center of Chongqing，Chongqing 401120，China；4.School of Pharmaceutical Sciences，Southwest University，Chongqing 400715，China）

Nuciferine was extracted from Nelumbo nucifera leaves by cellulase-assited ethanol reflux extraction method.Based on single factor tests，the method of orthogonal test with L9（34）was adopted，and the effects of pH value，enzymolysis temperature，cellulase dosage and enzymolysis time on the extraction rate of nuciferine were studied.The results showed that the optimum extraction condition was as follows：pH was 4.5，enzymolysis temperature was 45℃，cellulase dosage was 1.5 mg/g，and enzymolysis time was 50 min.Under these conditions，the extraction rate of nuciferine was 0.536%.The optimum extraction condition is reasonable and scientific，and it could be used in future large-scaled preparation.

Nelumbo nucifera leaves；nuciferine；cellulase；reflux method；extraction

S853.72

A

0529-6005（2016）09-0102-03

2015-08-03

國家科研平臺建設項目［發改高技（2013）2064號］；貴州省民族中獸藥與生態畜牧業人才基地項目［黔人領發（2013）15號］；貴州省高層次人才科研條件特助經費項目［黔人領發（2012）3號］；貴州省銅仁市科技局科研計劃項目［銅仁市研（2012）62號］

寧娜（1984-），女，副教授，博士，從事藥用資源的開發利用工作，E-mail：ningnaok@163.com