熒光微球免疫層析法快速檢測雞飼料中喹乙醇的含量

裴星瑤，王　旗，謝　潔，2，謝三磊，彭　濤，李向梅，江海洋

（1.中國農業大學動物醫學院，北京 海淀 100193；2.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 朝陽 100176）

熒光微球免疫層析法快速檢測雞飼料中喹乙醇的含量

裴星瑤1，王旗1，謝潔1，2，謝三磊1，彭濤1，李向梅1，江海洋1

（1.中國農業大學動物醫學院，北京 海淀 100193；2.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 朝陽 100176）

為更靈敏地進行全價雞飼料中喹乙醇（OLA）含量的快速檢測，本研究將新型標記物熒光微球與喹乙醇單克隆抗體偶聯，以該復合物為檢測試劑制備熒光微球免疫層析試紙條，在肉眼檢測的同時，將該裝置與熒光微球定量側向層析讀數儀聯合使用，可進行全價雞飼料中喹乙醇含量的定量快速檢測。研究結果證明，飼料中喹乙醇的定性和定量檢測限分別為100 μg/kg和0.51 μg/kg，IC50值為1.89 ng/mL，定量檢測回收率為78.71%～90.83%。該試紙條特異性強、準確性高，保存期長。定量檢測只需18 min左右，肉眼檢測需38 min左右，與相同抗原和抗體制備的膠體金試紙條相比，該方法可大大提高靈敏度。

喹乙醇；熒光微球；免疫層析；雞飼料

喹乙醇（OLA）被廣泛用于提高飼料轉化效率、加速動物生長和防止動物細菌疾病［1］。然而其不規范使用存在嚴重副作用，威脅家畜和人類健康［2］。鑒于此，歐盟于1998年禁止OLA使用［3］。然而當今OLA非法添加依然日趨嚴重，其中家禽和水產養殖飼料中使用居多，可能導致OLA殘留在雞肉和環境中。

OLA檢測方法發展迅速，其中傳統儀器分析方法已被大量報道，如高效液相色譜法（HPLC）［4-6］，液相色譜質譜聯用（LC/MS）［7-9］等。這些經典方法準確可靠，但由于操作復雜、成本昂貴，無法進行大量樣本實時分析［10］。此外，OLA免疫檢測方法也逐漸發展，其中酶聯免疫吸附試驗（ELISA）由于其固有優勢倍受關注［11］，然而，設備的需要，相對復雜的預處理和相對較低的效率限制了養殖場和市場中對ELISA方法的應用。

近年來，免疫層析檢測技術由于簡便快速、方便攜帶以及成本低的特性被逐漸應用。其中僅有一篇關于用膠體金試紙條檢測飼料中OLA的報道，但為定性檢測，LOD值（2 000 ng/mL）較高［12］，靈敏度不能滿足監測要求。因此，利用更靈敏的標記物建立同時定量、定性檢測雞飼料中OLA的免疫層析檢測方法極其必要。本文首次建立了熒光微球免疫層析法檢測OLA，提高了檢測靈敏度，為快速監測禽類養殖安全提供技術保障。

1　材料與方法

1.1主要材料與儀器牛血清白蛋白（BSA，99.9%），羊抗鼠二抗免疫球蛋白（G×M），購自美國Sigma-Aldrich公司；OLA單克隆抗體（Anti-OLA MAb，2.65 mg/mL）由本實驗室制備和儲存［13］；MES（上海超日公司）；熒光微球（0.22 μm）、EDC、NHS（美國Sigma-Aldrich公司）；PVC底板、樣品墊、吸水墊（上海杰一公司）；硝酸纖維素膜Millipore135（美國Millipore公司）；ZX1000噴膜儀（美國BioDot公司）；三用紫外分析儀WFH-203（ZF-1）（上海馳唐實業有限公司）；定量讀數儀（德國QIAGEN公司）。

1.2熒光微球偶聯抗體復合物的制備30 μL熒光微球加入1 mL MES（pH值6.0）中，混合后，加入反應劑10 μL EDC和10 μL NHS（均為0.5 mg/mL）活化15 min。用含有0%，1%，5%和10%BSA的純水溶液分別稀釋抗體至2.65 μg/mL，取30 μL抗體稀釋液逐滴加入熒光微球溶液中反應15 min，加入20 μL BSA（20%）封閉10 min，以10 000 r/min離心5 min，沉淀用200 μL復溶液重懸，4℃避光保存。

1.3熒光微球免疫層析試紙條制備

1.3.1樣品墊的制備在樣品墊處理液（含1% PVP和3‰NaN3的PB溶液）中分別加入0%、0.2%、0.4%、0.6%和0.8%的Tween-20，浸潤處理玻璃纖維素膜，37℃烘干4 h，比較其背景信號值、熒光強度和靈敏度。

1.3.2熒光微球免疫層析試紙條的組裝用噴膜儀將OLA-BSA（0.86 mg/mL）和羊抗鼠IgG（0.20 mg/mL）分別噴涂在NC膜上，37℃干燥30 min。將NC膜、樣品墊和吸水墊依次粘貼在PVC板上，用切條機裁成3.5 mm寬的試紙條。

1.4試紙條檢測方法和結果判定在ELISA微孔中加入3 μL標記偶聯物，加入150 μL樣品孵育3 min，將試紙條斜插入孔底。10 min后用讀數儀測量熒光強度，以B/B0為縱坐標，標準品濃度對數為橫坐標繪制標準曲線。隨后在37℃干燥20 min，紫外燈下肉眼觀察，若T線有熒光亮度，樣品中不含OLA或低于該方法檢測限，判為陰性；反之為陽性；C線為質控線。

1.5試紙條性能檢測

1.5.1特異性用PBST溶液稀釋OLA的結構類似物MQCA、MEQ、QCT、CBX以及其他藥物SAL、CLE和AFB1至100 ng/mL，用試紙條檢測，每個樣品重復3次評價其特異性。

1.5.2靈敏度（1）定性檢測：OLA標準品用0.02 mol/L PBS溶解，在蛋雞全價配合飼料中的添加濃度為1，2.5，5，10，25，50，100，200，300 μg/kg和400 μg/kg，提取稀釋后用試紙條檢測，肉眼獲取定性檢測限；（2）定量檢測：在PBST（含0.1 g K2CO3）溶液中添加OLA至終濃度為0、0.1、0.3、1、3、9、27 ng/mL和81 ng/mL，用試紙條檢測，繪制標準曲線，每個濃度重復5次。

1.6樣品前處理將全價配合雞飼料碾碎，準確稱取1±0.1 g飼料粉末，加入2 mL現配的甲醇-水（5∶95）提取液，顛倒混勻后靜置10 min，取1 mL上清液，用PBST（含0.1g K2CO3）稀釋3倍，混勻后儲存于4℃待檢。

2　結果

2.1抗體稀釋液的確定抗體稀釋液可影響熒光微球和抗體的結合狀態，該研究選用含1%BSA的純水稀釋抗體，增強了抗體活性和T線熒光強度，減少抗體浪費。但過多BSA搶占偶聯位點，起到類似封閉液的作用［14］，顯色降低（見圖1）。

圖1　抗體稀釋液的選擇結果（ng/mL）

2.2樣品墊的制備檢測結果表明，0.4%Tween-20加入樣品墊處理液跑樣速度較前二者快，靈敏度高（見圖2）。背景信號趨勢也表示Tween-20在一定范圍內可減少熒光微球抗體復合物與NC膜的非特異性結合，但過多的Tween-20會使抗體遷移速度過快，熒光值下降。

圖2　不同濃度的Tween-20調制樣品墊處理液的結果

2.3試紙條檢測效果

2.3.1試紙條的特異性試紙條與MQCA和MEQ有少量交叉反應，其明顯程度不影響肉眼判定，對其他分析物都無明顯交叉反應，證明試紙條具有良好的特異性。

2.3.2試紙條的靈敏度紫外光下肉眼觀察，試紙條的定性檢測限為100 μg/kg。用讀數儀測量熒光信號，以B/B0為縱坐標，樣品濃度對數為橫坐標繪制標準曲線，其線性范圍為0.39～43.71 ng/ mL（R2=0.9969），IC50為1.89 ng/mL，定量檢測限為0.51 μg/kg（見圖3）。

圖3　試紙條定性檢測靈敏度結果和定量檢測標準曲線

2.3.3穩定性和重復性試驗結果表明，試紙條在4℃和室溫儲存6個月后，熒光強度較穩定。分別選取同批次和不同批次的試紙條，在相同條件下檢測，結果表明，試紙條重復性良好。

2.3.4添加回收率在空白全價配合雞飼料中添加OLA至0.5、2、4 μg/kg，用試紙條檢測并計算其平均回收率為78.71%～90.83%。用試紙條與ELISA試劑盒同時檢測17份全價雞飼料樣本，陽性符合率為90.91%，陰性符合率為100%。

3　討論

本試驗發現熒光微球標記過程在整個試驗過程中的重要性，其優化直接影響到抗體與熒光微球的偶聯程度和蛋白活性。抗體稀釋液中的BSA，良好的反應強化劑或穩定劑，在本文中被作為一個重要調節參數。BSA常常被添加在ELISA檢測試劑中，提高穩定性，減少非特異性結合，加強蛋白反應的活性［15］。本試驗中選擇的BSA濃度，表現出最佳熒光強度和靈敏度。如果BSA過少，抗體和熒光微球偶聯體系不穩定，肉眼可見少量聚沉現象，且蛋白活性較低，T線熒光亮度較低。如果BSA過多，會占據偶聯位點，影響T線信號強度和靈敏度。同時，本試驗中添加的BSA能減少抗體的浪費。

試紙條的分辨率是評價其性能的指標之一。相對膠體金來說，熒光微球粒徑較大，增加了非特異性結合的可能，背景值在一定程度上會造成儀器讀數的誤差。熒光信號比較靈敏，細微的變化易引起結果的變異，并影響靈敏度。已有報道表明，樣品洗脫液中的Tween-20會通過調節層析速度提高免疫層析方法的靈敏度［16］。為了改善背景影響，我們利用0.4%Tween-20調制樣品墊，提高了T線熒光強度和靈敏度，建立了顯色清晰而判定靈敏的熒光微球免疫層析試紙條。實際證明本試紙條可以快速、靈敏、準確地檢測全價配合雞飼料中的OLA，為禽類養殖安全的監測提供基礎。

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Rapid Detection of Olaquindox in Chicken Feed Based on Fluorescent Microspheres Lateral Flow Assay

PEI Xing-yao1，WANG Qi1，XIE Jie1，2，XIE San-lei1，PENG Tao1，LI Xiang-mei1，JIANG Hai-yang1
（1.College of Veterinary Medicine，China Agricultural University，Beijing 100193，China；2.China Academy of Inspection and Quarantine，Beijing 100176，China）

In order to detect the olaquindox more sensitivily，the monoclonal antibodies of olaquindox were conjugated with the fluorescent microspheres to build a fluorescent microspheres immunoassay strip not only for the qualitative detection but also for the quantitative detection for olaquindox residue in complete pellet chicken feed，when the strip was coupled to a membrane strip reader.When the qualitative assay with the LOD of 100 ng/g and the quantitative assay with the LOD of 0.51 μg/kg for feed（IC50=1.89 were performed，coefficient of recovery was 78.71～90.83%.The test strip was demonstrated to have high specificity，satisfying accuracy and excellent stability.The fluorescent lateral flow assay which needs only 18 min for quantitative detection and 38 min for qualitative detection was confirmed to be more sensitive than colloidal gold technique developed with the same antigen and antibody.

olaquindox；fluorescent microspheres；immunofluorescence；chicken feed

JIANG Hai-yang

S859.79

A

0529-6005（2016）09-0083-03

2015-07-24

十二五國家科技支撐計劃課題（2015BAK36B03）

裴星瑤（1991-），女，碩士，研究方向為獸醫藥理學與毒理學，E-mail：beidoubujianbei@163.com，

江海洋，E-mail：haiyang@cau.edu.cn