ATRA對新城疫疫苗的體液免疫增強作用的研究

任　超，曹　威，張文波，金天明

（天津農學院動物科學與動物醫學學院，天津 西青 300384）

ATRA對新城疫疫苗的體液免疫增強作用的研究

任超，曹威，張文波，金天明

（天津農學院動物科學與動物醫學學院，天津 西青 300384）

為了研究全反式維甲酸（ATRA）對新城疫疫苗的體液免疫增強效果，本試驗選取1日齡AA肉雞作為研究對象，低劑量組和高劑量組分別灌服1 μmol/kg體重和5 μmol/kg體重ATRA，在7日齡和28日齡時對藥物對照組、低劑量組、高劑量組通過滴鼻、點眼的方法免疫新城疫疫苗。在7、14、21、28、35、42日齡和49日齡，每組隨機取7只雞，稱重，采集胸腺、脾臟、腔上囊和血清，計算胸腺、脾臟和腔上囊免疫器官指數，利用血凝抑制（HI）試驗檢測血清中新城疫抗體效價。結果表明，ATRA可以促進雛雞免疫器官生長，提高雛雞免疫器官指數和新城疫抗體效價，表明ATRA可以增強雛雞的體液免疫應答，且5 μg/kg體重劑量ATRA對新城疫疫苗的體液免疫增強效果更顯著。

ATRA；新城疫疫苗；體液免疫；免疫增強；免疫器官指數

全反式維甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）是維生素A的主要活性代謝衍生物，在免疫反應的調節與抑制腫瘤的發生方面起著重要的作用［1］。Kaufman等研究表明，維生素A稍有不足就會顯著削弱疫苗在腸黏膜誘導的保護性免疫反應，而短期補充維生素A就可以完全恢復機體的腸道免疫力，而且能夠促進效應性體液免疫反應和細胞免疫反應［2］。研究發現，口服或皮下注射的ATRA通過刺激皮膚引流淋巴結內的樹突狀細胞產生更多的ATRA并誘導嗜腸T、B淋巴細胞由腸外的淋巴組織歸巢到腸黏膜部位［3-4］。在白血病小鼠模型中，ATRA和DNA疫苗聯合應用能夠有效的促進INF-γ的產生和殺傷性T細胞的產生［5］?？梢夾TRA能夠有效的促進機體的黏膜免疫反應，并調動系統性免疫應答，協同提高機體的免疫力。因此，ATRA可以作為潛在的免疫增強劑，在畜禽疫苗免疫中發揮良好的免疫增強作用。本研究將ATRA配合新城疫Ⅳ系疫苗，探索ATRA對家禽體液應答的作用，為研發安全高效的禽用免疫增強劑開辟新的道路。

1　材料與方法

1.1實驗動物1日齡AA肉雞196只，購自天津景盛源實驗動物銷售有限公司。

1.2主要試劑ATRA（美國Sigma公司）；二甲基亞砜（DMSO，北京索萊寶科技有限公司）；新城疫Ⅳ系疫苗（哈藥集團生物疫苗有限公司）；新城疫標準陽性血清、新城疫標準陰性血清（中國獸醫藥品監察所）。

1.3主要儀器離心機（上海醫療儀器廠，LW-250A），振蕩器（金壇市龍盛實驗儀器廠，ZW-A），排槍（百得實驗室儀器（蘇州）有限公司，725010）。

1.4免疫程序制定ATRA用DMSO溶解，濃度為0.1 mg/L，-80℃保存。各組均為49只AA肉雞，在1日齡時，高劑量組和低劑量組分別灌服5 μmol/kg體重和1 μmol/kg體重的ATRA，連續灌服7 d，藥物對照組和免疫對照組分別灌服等量DMSO。在7日齡和28日齡時，高劑量組、低劑量組和藥物對照組分別免疫新城疫Ⅳ系疫苗，免疫劑量106.0EID50/羽，免疫途徑為滴鼻、點眼，免疫對照組免疫等量生理鹽水。

1.5樣品采集與處理在7、14、21、28、35、42日齡和49日齡，每組隨機取7只雞，翅靜脈采血，稱重，斷頸處死，采集胸腺、脾臟和腔上囊，稱重并計算免疫器官指數（免疫器官指數=免疫器官鮮重（g）/宰前活重（g）×100%）。將血液分離血清，利用血凝抑制（HI）試驗檢測血清中新城疫抗體效價。試驗數據利用SPSS11.5軟件進行統計與分析，圖表用Graphad Prism軟件繪制，以（D）表示。

2　結果

2.1免疫器官指數的測定脾臟免疫器官指數在14日齡時低劑量組顯著高于免疫對照組（P＜0.05）；21日齡時高劑量組顯著高于免疫對照組（P＜0.05）；28日齡時高劑量組、低劑量組均顯著高于藥物對照組（P＜0.05）；35日齡時各組差異不顯著（P＞0.05）；42日齡時高劑量組、低劑量組均顯著高于藥物對照組（P＜0.05）；49日齡時高劑量組、低劑量組均顯著高于免疫對照組（P＜0.05）（見圖1）。所以ATRA可以促進脾臟生長，提高雛雞脾臟免疫器官指數。

圖1　脾臟免疫器官指數圖

腔上囊免疫器官指數在14日齡和49日齡時各組差異不顯著（P＞0.05）；21日齡時高劑量組極顯著高于免疫對照組（P＜0.01）；28日齡時高劑量組極顯著高于免疫對照組（P＜0.01），低劑量組極顯著高于藥物對照組（P＜0.01）；35日齡時高劑量組顯著高于免疫對照組、藥物對照組和低劑量組（P＜0.05），低劑量組顯著高于免疫對照組（P＜0.05）；42日齡時高劑量組極顯著高于藥物對照組和低劑量組（P＜0.01）（見圖2）。所以ATRA可以促進腔上囊生長，提高雛雞腔上囊免疫器官指數。

圖2　腔上囊免疫器官指數圖

胸腺免疫器官指數在14日齡時高劑量組極顯著高于免疫對照組（P＜0.01），低劑量組顯著高于免疫對照組（P＜0.05）；21日齡時高劑量組顯著高于免疫對照組和藥物對照組（P＜0.05），低劑量組極顯著高于免疫對照組（P＜0.01），低劑量組顯著高于藥物對照組（P＜0.05）；28日齡時高劑量組顯著高于免疫對照組（P＜0.05）；35日齡時各組差異不顯著（P＞0.05）。所以ATRA可以促進胸腺生長，提高雛雞胸腺免疫器官指數（見圖3）。

圖3　胸腺免疫器官指數圖

2.2新城疫抗體效價測定免疫對照組的新城疫抗體水平逐漸下降，而藥物對照組、高劑量組、低劑量組的新城疫抗體水平在1免后逐漸上升，在28日齡（1免后21 d）達到高峰；2免后藥物對照組、高劑量組、低劑量組的新城疫抗體水平繼續上升，在42日齡（2免后14 d）第二次達到高峰，并維持至49日齡。新城疫抗體效價在14日齡時（1免后7 d）各組差異不顯著（P＞0.05）；21日齡時（1免后14 d）高劑量組顯著高于藥物對照組（P＜0.05）；28日齡時（1免后21 d）高劑量組、低劑量組分別顯著高于藥物對照組（P＜0.05）；35日齡時（2免后7 d）高劑量組顯著高于藥物對照組（P＜0.05）；42日齡時（2免后14 d）高劑量組極顯著高于藥物對照組（P＜0.01），高劑量組顯著高于低劑量組（P＜0.05），低劑量組顯著高于藥物對照組（P＜0.05）；49日齡時（2免后21 d）高劑量組極顯著高于藥物對照組（P＜0.01），高劑量組顯著高于低劑量組（P＜0.05）。由此可見在ATRA的作用下，雛雞的新城疫抗體效價顯著提高，且高劑量組的抗體增長水平較其他組更顯著（見圖4）。

圖4　新城疫抗體效價圖

3　討論

胸腺、腔上囊和脾臟是禽類最重要的免疫器官，其發育狀態及機能強弱對禽類的免疫水平有很大的影響，免疫器官的重量相對增加，說明機體的免疫機能增強［6］。從結果可知，ATRA能夠促進胸腺、腔上囊和脾臟的生長，提高機體的免疫機能，促進體液免疫反應。

ATRA通過大量表達核視網膜酸受體（RARα，-β和γ）產生信號，促進多種免疫細胞的發育和分化，增強T細胞分化，上調T細胞歸巢受體的表達，促進sIgA分泌型細胞的發育，ATRA在黏膜免疫反應中發揮重要的作用［7］。同時，ATRA也是維生素A衍生物中最強有力的恢復體液免疫反應的活性物質，可以增強Th2型細胞的分化，抑制Th1型細胞的分化，促進基因免疫誘生Th2型免疫應答，抑制Th1型免疫應答，從而改變基因免疫，誘生特異性體液免疫反應［8］。本試驗不同濃度ATRA對新城疫疫苗的免疫效果影響，從結果可知，ATRA可以提高新城疫的抗體效價，增強體液免疫應答，且5 μg/kg體重劑量ATRA對新城疫疫苗的免疫增強效果更顯著。

［1］劉爽，湯鋒，劉琦，等.全反式維甲酸對卵巢上皮腺癌細胞株抑制作用的實驗研究［J］.中華臨床醫師雜志，2013，7（4）：1601-1604.

［2］Kaufman D R，De Calisto J，Simmons N L，et al.Vitamin A Deficiency Impairs Vaccine-Elicited Gastrointestinal Immunity［J］.J Immunol，2011，187（4）：1877-1883.

［3］Hammerschmidt S I，Friedrichsen M，Boelter J，et al.Retinoic acid induces homing of protective T and B cells to the gut after subcutaneous immunization in mice［J］.J Clin Invest，2011，121（8）：3051-3061.

［4］Villablanca E J，Wang S，De Calisto J，et al.MyD88 and Retinoic Acid Signaling Pathways Interact to Modulate Gastrointestinal Activities of Dendritic Cells［J］.Gastroenterology，2011，141（1）：176-185.

［5］Kouichi F，Katerina P，Carole L P，et al.DNA vaccination with all-trans retinoic acid treatment induces long-term survival and elicits specific immune responses requiring CD4+and CD8+T-cell activation in an acute promyelocytic leukemia mouse model［J］.Blood，2010，115（3）：653-656.

［6］李亞杰，趙獻軍.益生菌、黃芪多糖微膠囊制劑對肉仔雞生長性能、免疫器官指數及血液生化指標的影響［J］.安徽農業科學，2007，35（1）：100-103.

［7］Svensson M，Johansson-Linbom B，Zapata F，et al.Retinoic acid receptor signaling levels and antigen dose regulate gut homing receptor expression on CD8 T cells［J］.Mucosl Immunol，2008，1：38-48.

［8］喻三紅，夏明燦，王立新，等.全反式維甲酸對基因免疫應答的調節作用［J］.中華微生物學和免疫學雜志，2004，24（5）：337-340.

TheImmuneenhancement of ATRA in Humoral Immune Responsefor NewcastleDiseaseVaccine

REN Chao，CAO Wei，ZHANG Wen-bo，JIN Tian-ming
（Department of Animal Sciences and Veterinary Medicine，Tianjin Agricultural University，Tianjin 300384，China）

In order to study the immunity enhancement of ATRA for Newcastle Disease（ND）vaccine，1-day-old AA broilers were treated with ATRA at 1 mmol/kg and 5 mmol/kg respectively.At the 7thday and 28thday the drug control group，low dose group，and high dose group were immunized with ND vaccine by intranasal and eye immunization approach.At the 7th，14th，21st，28th，35th，42ndand 49thday 7 chickens in each group were randomly selected to be weighed，and the thymus，spleen，bursa and serum were collected for calculating the thymus，spleen and bursa immune organ index and detecting the ND specific antibody titers with HI test.The results showed that ATRA could promote the immune organ growth to improve the immune organ index and ND specific antibody titers.Meanwhile，ATRA also extended the duration of the ND specific antibody titers，indicating that ATRA enhanc the humoral immune response of chickens，and the immune enhancing effect for ND vaccine of the group treated with ATRA at 5 μg/kg was significantly differencet.

ATRA；ND vaccine；humoral immunity；immune enhancement；immune organ index

JIN Tian-ming

S852.65+9.5

A

0529-6005（2016）09-0019-03

2015-07-10

天津農學院科技發展基金項目（2013N09）；天津市高?！矮F醫生物技術”創新團隊項目（TD12-5019）；天津市高等學校創新團隊培養計劃基金資助項目（TNTD2015015）

任超（1986-），女，實驗師，碩士，研究方向為基礎獸醫學，E-mail：chaoren04050110@163.com

金天明，E-mail：jtm680@163.com