豬傳染性胃腸炎病毒S基因A、D抗原共表達的復制缺陷型重組腺病毒構建及鑒定

劉文曉，高志強，蒲　靜，張　偉，劉　環，牛建蕊，張鶴曉

（1.北京森康生物技術開發有限公司，北京 懷柔 101400；2.北京出入境檢驗檢疫局，北京 朝陽 100026）

豬傳染性胃腸炎病毒S基因A、D抗原共表達的復制缺陷型重組腺病毒構建及鑒定

劉文曉1，高志強2，蒲靜2，張偉2，劉環2，牛建蕊1，張鶴曉2

（1.北京森康生物技術開發有限公司，北京 懷柔 101400；2.北京出入境檢驗檢疫局，北京 朝陽 100026）

通過RT-PCR技術和重疊PCR技術擴增出含有豬傳染性胃腸炎病毒S基因的A抗原表位和D抗原表位，構建復制缺陷型腺病毒穿梭質粒。穿梭質粒與腺病毒骨架質粒經PacI線性化之后，共同轉染AD-293細胞，獲得共表達A、D抗原表位的復制缺陷型重組腺病毒。經Western Blotting檢測，該重組腺病毒能夠正確表達目的蛋白基因，而且目的蛋白能夠與豬傳染性胃腸炎陽性血清反應。本研究結果為豬傳染性胃腸炎重組疫苗研發奠定基礎。

豬傳染性胃腸炎；復制缺陷型腺病毒；疫苗

豬傳染性胃腸炎是由豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）引起的一種急性、高度傳染性疾病。不同品種和年齡的豬均易感染此病，其中兩周齡以內的仔豬病死率高達100%。近年來，該病在我國的流行形式日趨嚴峻，嚴重影響了我國養豬業的發展。由于該病無有效治療方法，疫苗預防是控制該病流行與發展的重要措施。現在應用較多的是常規疫苗（弱毒苗、滅活苗或三聯苗），但是，其存在很多缺陷，如潛伏感染、散毒、毒力返強等。因此，應用基因工程改造技術研發新型疫苗對該病的防控具有重大意義。

TGEV的基因組編碼4種結構蛋白（S蛋白、M蛋白、N蛋白和sM蛋白）和4種非結構蛋白［1］。S蛋白，又稱纖突蛋白，位于病毒粒子表面，是惟一能夠誘導產生中和抗體與提供免疫保護作用的結構蛋白。S蛋白的氨基端有4個抗原位點A、B、C、D，其中A、D位點序列高度保守，是主要誘導機體產生中和抗體的抗原位點［2］。

復制缺陷型重組腺病毒載體是一種免疫原性很強的高效活疫苗載體。它可以通過注射、口服、滴鼻等途徑進行免疫，同時誘導產生針對載體和目的蛋白的體液免疫和細胞免疫，還能誘導局部產生黏膜免疫應答。本研究旨在通過復制缺陷型腺病毒載體共表達S蛋白的A、D抗原，模擬野生毒株表面的線性和非線性的抗原表位，刺激機體產生與自然野毒感染相似的免疫應答，為新型疫苗研發奠定基礎。

1　材料與方法

1.1質粒、菌株與細胞RAPAD CMV腺病毒表達系統，購自Cell Biolabs，INC。AD-293細胞為本實驗室保存。

1.2主要試劑M-MLV反轉錄酶由北京出入境檢驗檢疫局研發。RNA酶抑制劑，購自Promega公司。病毒RNA柱式提取試劑盒為北京森康生物技術開發有限公司產品。限制性內切酶、DNA純化試劑盒等，購自寶生物工程（大連）有限公司。Trans-IT-2020轉染試劑，購自Mirus bio公司。

1.3引物根據TGEV Purdue 115株的S基因序列，利用軟件Primer Premier 5.0設計引物P1：5′-GGAATTCATGTTAGTTACCAAACAGCCGT-3′與引物P2：5′-AACTTGGGATCCTATTGTCCAGAAAA-3′，分別帶有EcoR I與BamH I酶切位點，用于擴增A抗原表位的序列，長度為501 bp。引物P3：5′-CGGGATCCCAAGTTGAAAACACAG-3′與引物P4：5′-GCTCTAGAACTATTATCAGACGGT-3′，分別帶有BamH I與Xba I酶切位點，用于擴增D抗原表位的序列，長度為606 bp。

圖1　重疊PCR擴增含有TGEV S基因A、 D抗原表位的技術路線

1.4豬傳染性胃腸炎基因sAD擴增通過RTPCR方法分別擴增A、D抗原表位的序列，同時通過重疊PCR技術合成編碼A、D表位的完整的DNA片斷（圖1）。提取TGEV RNA，以OligodT為引物進行反轉錄獲得TGEV cDNA，分別擴增A、D表位的序列sA、sD，。以P1、P4為引物，sA、sD為模板擴增sAD，經瓊脂糖凝膠純化回收之后，連接pMD19-T載體，篩選含有sAD序列的pMD19-T陽性重組質粒pMD19-T-sAD。將含有陽性克隆質粒的菌液送往英濰捷基（上海）貿易有限公司測序，進行序列分析。

1.5含有Sad基因的腺病毒穿梭質粒的構建利用限制性內切酶EcoRI、XbaI酶切質粒pMD19-T-sAD與pacAd5 CMV K-N pA，構建含有sAD片段的重組質粒，PCR鑒定篩選陽性克隆株，命名為pShuttle-sAD。

1.6含有TGEV AD抗原表位的復制缺陷型重組腺病毒的組裝使用無內毒素質粒大提試劑盒提取穿梭質粒pShuttle-sAD，pacAd5 CMV eGFP與骨架質粒pacAd5 9.2-100，經pacI酶切之后，回收。參考轉染試劑盒的說明書方法，將酶切之后的穿梭質粒與骨架質粒DNA共同轉染AD-293細胞，轉染10 d之后，收獲復制缺陷型重組腺病毒。

1.7復制缺陷型重組腺病毒的鑒定與遺傳穩定性檢測取連續擴大傳代的重組腺病毒與正常的AD-293細胞培養液各1 mL，提取RNA，通過RT-PCR方法檢測目的基因。

1.8復制缺陷型重組腺病毒的TCID50的測定按照常規方法，將連續擴大傳代的重組腺病毒進行10倍梯度稀釋，接種于含有AD-293細胞的96孔細胞培養板，37℃培養7 d，逐日觀察細胞病變，按照Reed-Muench方法計算TCID50。

1.9目的蛋白的免疫原性檢測將上一步收獲得到的復制缺陷型重組腺病毒病毒液進行處理，離心取上清進行SDS-PAGE和Western Blotting檢測。其中，一抗為自制的抗TGEV的豬血清（1∶100稀釋），二抗為HRP標記的羊抗豬抗體（1∶1 000稀釋）。

2　結果與分析

2.1重組腺病毒穿梭質粒構建通過RT-PCR方法分別擴增含有A、D抗原表位的序列，見圖2，利用重疊PCR技術合成同時含有A、D表位的序列sAD，見圖3。分別雙酶切sAD片段和質粒pacAd5 CMV KN pA，構建重組穿梭質粒。陽性克隆株測序結果表明，重組穿梭質粒中含A、D抗原基因，無突變，成功構建重組穿梭質粒pShuttle-sAD。

2.2復制缺陷型重組腺病毒的包裝利用限制性內切酶pacI酶切骨架質粒及穿梭質粒，質粒pacAd5 9.2-100經酶切后產生約33.0 kb與2.0 kb的兩條帶（泳道2），酶切后的穿梭質粒為單一條帶（泳道4，6），與預期結果相符，見圖4。

圖2　PCR擴增TGEV S基因A、D抗原表位的序列

圖3　PCR擴增含有A、D抗原表位的序列

圖4　重組腺病毒穿梭質粒與骨架質粒的線性化

將線性化的穿梭質粒與骨架DNA同時轉染293細胞，10 d出現典型的細胞病變，細胞變圓，細胞核固縮，最后脫落，見圖5。收獲第一代復制缺陷型重組腺病毒，分別命名為rAd-sAD、rAd-eGFP。

2.3復制缺陷型重組腺病毒的鑒定及遺傳穩定性檢測將第一代腺病毒rAd-sAD接種于293細胞，逐日觀察，3 d后開始出現細胞病變，收獲病毒，連續傳代至第10代。檢測每一代病毒內目的基因DNA和轉錄水平，均得到大小約為1 107 bp的特異性條帶，結果表明，sAD基因在rAd-sAD內能夠穩定存在，見圖6。

圖5　復制缺陷型重組腺病毒感染AD-293細胞的細胞病變（10×40）

測定各代病毒的TCID50，結果顯示，隨著病毒傳代，rAd-sAD的病毒滴度逐代增加，至第6代逐漸穩定，TCID50為108.375/mL（見圖7）。

第10代重組腺病毒rAd-sAD的sAD基因測序結果顯示，無核苷酸突變。綜上所述，該重組腺病毒rAd-sAD遺傳性狀穩定。

2.4目的蛋白的免疫原性檢測將rAd-sAD感染AD-293細胞，出現細胞病變之后，收集病毒液，進行SDS-PAGE與Western Blotting檢測。結果顯示，在40 kD處能夠檢測到深色印跡，而正常細胞無此印跡（見圖8）。結果表明，A、D抗原能夠在該復制缺陷型重組腺病毒內表達，而且具有反應原性。

3　討論

圖6　rAd-sAD的PCR鑒定

圖7　重組腺病毒病毒滴度測定

圖8　Western Blotting檢測

豬傳染性胃腸炎病毒致病性強，治療效果不顯著，疫苗防控一直是預防該病發生與流行的重要措施。針對TGEV的疫苗研發一直以來備受關注。1996年，研究人員已經自主研發出針對豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒的二聯氫氧化鋁細胞滅活苗。隨后，又研發出二聯弱毒苗［3］。這些常規疫苗在一定程度上能夠降低TGEV的發病率和死亡率，但是效果不理想。

現在，多種基因工程疫苗研發技術已經應用到TGEV疫苗研發領域。S蛋白一直被作為研究新型疫苗的靶點，廣泛應用于亞單位疫苗、活載體疫苗研究領域。Shoup等利用桿狀病毒系統表達提取TGEV S蛋白作為亞單位疫苗，在給豬進行弱毒苗免疫之后，再用S蛋白進行加強免疫，能夠顯著提高母豬的母源抗體水平，提高對仔豬的保護率，但是單獨使用該蛋白作為亞單位苗免疫效果不佳［4］。Smerdo等利用原核表達系統將S蛋白克隆至鼠傷寒沙門菌致弱菌株中，該重組疫苗經口服免疫可以刺激機體產生針對TGEV的特異性抗體。Tuboly等利用同源重組的方法將全長的S基因克隆至5型腺病毒載體上，經口服免疫，能夠在豬體內檢測到針對TGEV和5型腺病毒的特異性抗體［1］，解決機體針對該載體產生的免疫反應是將其進一步推廣使用的關鍵因素。這些基因工程疫苗候選株在一定程度上克服了現有常規疫苗存在的缺陷，但是其免疫原性低，仍然不能達到的預期免疫效果。盡管如此，這些技術的出現為新型安全有效疫苗的研發提供了新的研究思路。

腺病毒載體基因組易于改造，病毒滴度高，安全性能好，能夠誘導機體產生強烈的細胞免疫和體液免疫。經過研究人員對其基因組的改造，研發出新一代復制缺陷型腺病毒載體。這種載體缺失了負責編碼腺病毒早期轉錄蛋白的E1區，缺失E1區的腺病毒不能有效復制和產生各種病毒蛋白，必須在能夠提供E1基因功能的細胞株內復制。這在一定程度上能夠降低機體針對載體產生的免疫效應。本研究利用腺病毒表達系統，構建了同時含有TGEV S蛋白的A、D抗原表位的穿梭質粒，將該穿梭質粒與腺病毒骨架質粒線性化之后共同轉染AD-293細胞，獲得復制缺陷型重組腺病毒。通過RT-PCR、Western Blotting檢測，結果表明該復制缺陷型重組腺病毒能夠成功表達TGEV S蛋白的A、D抗原，而且能夠與陽性血清發生反應，具有較好的反應原性。下一步將重組腺病毒免疫豬，研究其誘導機體產生針對TGEV的中和抗體的能力，為新型豬傳染性胃腸炎疫苗研發奠定基礎。

［1］Gebauer F.PWCI，Residues involved in the antigenic sites of transmissible gastroenteritis virus S glycoprotein［J］.Virology，1991，1：225-238.

［2］佟有恩，馮力，李偉杰，等.豬傳染性胃腸炎與豬流行性腹瀉二聯弱毒疫苗的研究［J］.中國預防獸醫學報，1999，43（6）：406-410.

［3］李樹根，周仲芳，李力復，等.豬流行性腹瀉弱毒和豬傳染性胃腸炎弱毒二聯疫苗研究［J］.中國獸醫雜志，2000，36（8）：5-8.

［4］Jones T，PGPD.Transmissible gastroenteritis of pigs［J］.Vet Rec，1997，16：427.

Construction and Identification of Replication defectiveRecombinant Adenovirus Expressing A and D epitopeof S protein genein Transmissiblegastroenteritis virus

LIU Wen-xiao1，GAO Zhi-qiang2，PU Jing2，ZHANG Wei2，LIU Huan2，NIU Jian-rui1，ZHANG He-xiao2
（1.Beijing Senkang Biotech Development Co.，Ltd，Beijing 101400，China；2.Beijing Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Beijing 100026，China）

RT-PCR and overlap PCR were used to amplify the A and D epitope of spikes protein（S protein）gene in Transmissible gastroenteritis virus（TGEV）.The A and D epitope genes were introduced into the shuttle vector.To generate the recombinant adenovirus，the shuttle vector containing the gene of interest and the recombinant adenoviral backbone were co-transfected into AD-293 cells.RT-PCR was applied to detect the genes of A and D proteins in the recombinant adenovirus.The Western blotting results revealed that the A and D genes were properly expressed，and the expressed protein could react with TGEV-positive serum. The study sets a foundation for the preparation of recombinant vaccine to control TGEV infection.

Transmissible gastroenteritis virus；Non-replicative recombinant adenovirus；Vaccine

ZHANG He-xiao

S855.3

A

0529-6005（2016）09-0003-04

2015-11-12

北京市優秀人才培養資助青年骨干個人項目（2015-000097607G290）

劉文曉（1985-），女，博士，主要從事動物疫病檢測技術研究，E-mail：lwx232210809@163.com

張鶴曉，E-mail：aqlzhx@126.com