基于SELDI-TOF-MS技術(shù)的奶牛乳熱血漿蛋白質(zhì)組學(xué)分析

舒　適，夏　成，張洪友，許楚楚，李昌盛，肖鑫煥，王　剛

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

基于SELDI-TOF-MS技術(shù)的奶牛乳熱血漿蛋白質(zhì)組學(xué)分析

舒適，夏成，張洪友，許楚楚，李昌盛，肖鑫煥，王剛

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

奶牛乳熱是圍產(chǎn)期奶牛營(yíng)養(yǎng)代謝性疾病，對(duì)于奶牛乳熱在病理方面少有血漿蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。本研究目的是探究奶牛乳熱在蛋白質(zhì)組學(xué)層面的變化。試驗(yàn)21頭患有奶牛乳熱的奶牛和59頭健康奶牛作為試驗(yàn)動(dòng)物。試驗(yàn)通過(guò)SELDI-TOF-MS技術(shù)檢驗(yàn)得到24個(gè)差異肽段的峰值，其中10個(gè)肽段經(jīng)過(guò)Swissport Protein數(shù)據(jù)庫(kù)搜索鑒定為10種差異蛋白。結(jié)果相對(duì)于對(duì)照組，乳熱組中表達(dá)上調(diào)的蛋白4個(gè)；表達(dá)下調(diào)的蛋白2個(gè)；還有既表達(dá)上調(diào)又表達(dá)下調(diào)的蛋白4個(gè)。結(jié)論本次試驗(yàn)應(yīng)用SELDI-TOF-MS技術(shù)鑒定了幾個(gè)在奶牛發(fā)生乳熱時(shí)表達(dá)的差異蛋白質(zhì)。這些發(fā)現(xiàn)也為以后揭示奶牛乳熱代謝性改變提供了依據(jù)。

SELDI-TOF-MS技術(shù)；蛋白質(zhì)組學(xué)；乳熱；奶牛

奶牛乳熱是高產(chǎn)奶牛常發(fā)的一種代謝性疾病。乳熱能引起患病奶牛發(fā)生某些重要的疾病，如乳腺炎，酮病，胎衣不下，真胃變位以及子宮脫出等。奶牛乳熱以低鈣血癥為特征，當(dāng)奶牛血鈣濃度降低時(shí)，機(jī)體將通過(guò)增加甲狀旁腺素分泌和1，25二羥維生素D3生成來(lái)調(diào)控血鈣水平［1］。

表面增強(qiáng)激光解析/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（SELDITOF-MS）是一種新發(fā)展的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)。與傳統(tǒng)的熒光雙向凝膠電泳相比，SELDI-TOF-MS可以應(yīng)用不同的色譜層析表面來(lái)運(yùn)送蛋白點(diǎn)，并且具有操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短、尋找差異蛋白廣泛的優(yōu)點(diǎn)［2］。近年來(lái)，SELDI-TOF-MS技術(shù)廣泛應(yīng)用于乳腺癌、嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征以及藥物發(fā)現(xiàn)的研究。

有關(guān)奶牛乳熱發(fā)生的病因?qū)W涉及生理、生化、病理等多方面應(yīng)用SELDI蛋白芯片的方法探索該病的研究少有報(bào)道。本研究目的在于應(yīng)用SELDI技術(shù)進(jìn)一步從蛋白組學(xué)角度探索奶牛乳熱發(fā)生時(shí)機(jī)體可能出現(xiàn)功能變化。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物在黑龍江某集約化養(yǎng)牛場(chǎng)選取荷斯坦奶牛80頭作為試驗(yàn)動(dòng)物，根據(jù)其血鈣濃度和臨床表現(xiàn)將其分為乳熱組（T，Ca＜1.50 mmol/L和明顯臨床癥狀）和健康對(duì)照組（C，Ca＞2.20 mmol/L和無(wú)臨床癥狀）（表1）。

表1　試驗(yàn)?zāi)膛５哪挲g、胎次和血鈣平均水平（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）

1.2血漿檢測(cè)在患病和正常奶牛分娩當(dāng)天6 h內(nèi)，尾靜脈采血10 mL。肝素抗凝，迅速離心（3 000 r/min離心5 min）分離血漿，置于-80℃冰箱冷凍保存。應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀（modullarDPP，德國(guó)羅氏），血漿鈣試劑盒（651564-01，德國(guó)羅氏）檢測(cè)。

1.3SELDI-TOF-MS試驗(yàn)

1.3.1樣品處理-80℃冰箱中取出血清樣品冰盒上融解，10 000 r/min（4℃）離心5 min；每個(gè)芯片點(diǎn)需要奶牛血清10 μL，將血清用1倍體積U9緩沖液稀釋，冰浴振蕩30 min；將20 μL樣品加入180 μL相應(yīng)的CM10結(jié)合緩沖液，混勻后上樣到芯片上。

1.3.2芯片處理芯片每孔加入10 Mm HCl 5 μL放入濕盒中清洗5 min，洗滌后棄去液體加入5 μL HPLC級(jí)超純水震搖洗滌5 min；CM10蛋白芯片每孔加入100 μL洗脫緩沖液室溫劇搖孵育5 min；棄去洗脫緩沖液加入100 μL樣品，劇搖孵育60 min。棄去樣品加入100 μL洗脫緩沖液室溫劇搖孵育5 min后棄去洗脫緩沖液，每孔加入100 μL HPLC級(jí)超純水震搖洗滌5 min；棄去水溶液，將芯片取出干燥10～15 min，SELDI上分析蛋白芯片。

2　結(jié)果

2.1SELDI-TOF-MS檢測(cè)結(jié)果以及預(yù)測(cè)蛋白通過(guò)Ciphergen ProteinChip軟件對(duì)在兩組差異峰圖進(jìn)行分析。將兩組之間的數(shù)據(jù)峰值做Wilcoxon統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。篩選出P值小于0.01的差異峰，并獲得了37個(gè)差異峰。并選取預(yù)測(cè)蛋白結(jié)果中差異最顯著的點(diǎn)，即m/z為3898.65點(diǎn)，通過(guò)Trace view和Gel view分別展示（見(jiàn)中插彩版圖1）。

在得到的37個(gè)差異峰中，經(jīng)Swissport蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)檢索蛋白作為差異峰可能的蛋白預(yù)測(cè)結(jié)果。獲得24個(gè)可預(yù)測(cè)的差異峰（P＜0.01），預(yù)測(cè)蛋白10種。相對(duì)于C組，在T組中有4個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào)（補(bǔ)體蛋白c3，淀粉樣蛋白βA4蛋白，血清蛋白，海帕西啶），2個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)（血漿蛋白酶c1抑制劑，載脂蛋白A2）和4個(gè)蛋白既表達(dá)上調(diào)又表達(dá)下調(diào)（纖維蛋白原α鏈，VGF，血清淀粉樣蛋白α，胱抑素c）。

2.2生物信息學(xué)分析應(yīng)用Cytoscape軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的10種蛋白進(jìn)行牛類基因網(wǎng)絡(luò)搜索，并得到Networks分析結(jié)果圖，數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)源于網(wǎng)絡(luò)軟件STRING。根據(jù)搜索結(jié)果，本試驗(yàn)有6種蛋白質(zhì)可在數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索得到結(jié)果，分別是HAMP，SAA1，ALB，C3，CST3和APP。并得到其相關(guān)的Networks分析結(jié)果，見(jiàn)中插彩版圖2。

3　討論

本試驗(yàn)在T組獲得了4個(gè)表達(dá)上調(diào)的蛋白，2個(gè)表達(dá)下調(diào)的蛋白，以及4個(gè)既表達(dá)上調(diào)，又表達(dá)下調(diào)的蛋白。

首先，4個(gè)表達(dá)上調(diào)的蛋白分別是complement c3 frag、amyloid beta a4 protein、serum albumin frag、hepcidin。當(dāng)奶牛發(fā)生乳熱時(shí)，免疫細(xì)胞對(duì)刺激的敏感性降低，可導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，由炎癥活化巨噬細(xì)胞分泌的一種在免疫系統(tǒng)中具有中心作用的C3補(bǔ)體片段和能夠通過(guò)鐵加載和激活炎癥反應(yīng)的海帕西啶［3］均在乳熱組表達(dá)上調(diào)，提示在乳熱發(fā)生過(guò)程中，補(bǔ)體系統(tǒng)發(fā)揮作用以提高機(jī)體免疫防御功能，但是否與海帕西啶有關(guān)尚不知曉。另外，β淀粉樣蛋白表達(dá)上調(diào)產(chǎn)生神經(jīng)毒素而導(dǎo)致老年癡呆癥，乳熱奶牛時(shí)常表現(xiàn)精神沉郁和癱瘓等癥狀，是否與它有關(guān)需要進(jìn)一步證實(shí)。雖然血清白蛋白與奶牛乳熱發(fā)生的關(guān)系未見(jiàn)報(bào)道，但本試驗(yàn)的結(jié)果對(duì)兩者關(guān)系研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

其次，2個(gè)表達(dá)下調(diào)的蛋白：plasma protease c1 inhibitor frag、apolipoprotein a-2。C1抑制劑作為炎癥反應(yīng)重要的抑制劑［4］，在乳熱奶牛炎性疾病發(fā)生時(shí)，其表達(dá)下調(diào)，表明未發(fā)揮其抑制炎癥的作用。近期的研究表明，載脂蛋白（ApoA-II）與心血管疾病有關(guān)，它可以運(yùn)載一些蛋白來(lái)抵抗這種疾病。當(dāng)ApoA-II表達(dá)下調(diào)時(shí)，可引發(fā)心血管疾病，提示可能與奶牛發(fā)生乳熱時(shí)出現(xiàn)心動(dòng)過(guò)速，心律不齊有關(guān)。C1抑制劑和ApoA-II與乳熱奶牛的關(guān)系也需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

此外，4個(gè)即表達(dá)上調(diào)，又表達(dá)下調(diào)的蛋白。

纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成纖維蛋白是凝血過(guò)程中一個(gè)重要的過(guò)程［5］，而Ca2+在這個(gè)過(guò)程中起到促進(jìn)作用。纖維蛋白原表達(dá)上調(diào)可能與奶牛乳熱繼發(fā)的炎癥反應(yīng)相關(guān)；而纖維蛋白原表達(dá)下調(diào)則可能與血液凝固通路有關(guān)，纖維蛋白原大部分轉(zhuǎn)化成纖維蛋白，同時(shí)消耗大量的Ca2+，可能是血漿鈣濃度降低的一個(gè)因素。這也與之前C1抑制劑促進(jìn)凝血的觀點(diǎn)相一致。

當(dāng)機(jī)體發(fā)生神經(jīng)受損、炎癥反應(yīng)時(shí)，VGF會(huì)表達(dá)上調(diào)［6］。而當(dāng)機(jī)體發(fā)生老年癡呆癥都會(huì)引起VGF的下調(diào)［7］。與上述結(jié)論相同，VGF的表達(dá)上調(diào)可能與乳熱奶牛的炎癥反應(yīng)相關(guān)；而VGF表達(dá)下調(diào)則與β淀粉樣蛋白表達(dá)上調(diào)引起老年癡呆癥，可能與奶牛表現(xiàn)精神沉郁有關(guān)，但是仍需要進(jìn)一步研究。

SAA可增加HDL分解代謝，降低血清膽固醇脂化、改變HDL分布［8］。SAA表達(dá)上調(diào)可能與奶牛發(fā)生乳熱后，機(jī)體繼發(fā)感染的時(shí)間有關(guān)；而SAA表達(dá)下調(diào)可使HDL分解代謝降低，這也與上述Apo-AII表達(dá)下調(diào)的結(jié)果相一致。

奶牛乳熱發(fā)生時(shí)，機(jī)體免疫力下降，這可能與胱抑素C表達(dá)上調(diào)使免疫應(yīng)答受阻相關(guān)；血漿鈣濃度降低是奶牛乳熱的一個(gè)重要標(biāo)志指標(biāo)，而當(dāng)血漿鈣濃度降低時(shí)，正常機(jī)體會(huì)使腎臟對(duì)Ca2+的重吸收增加，以恢復(fù)血漿鈣濃度，而患病時(shí)，胱抑素C表達(dá)下調(diào)直接反映腎小球?yàn)V過(guò)率降低［9］，這可能與腎臟對(duì)Ca2+重吸收未發(fā)揮作用有關(guān)。

這4種蛋白質(zhì)在本試驗(yàn)中既表達(dá)上調(diào)又表達(dá)下調(diào)，可能與蛋白質(zhì)本身參與的生理病理過(guò)程有關(guān)，奶牛發(fā)生乳熱時(shí)引起這些蛋白上、下調(diào)的同時(shí)變化的現(xiàn)象，值得進(jìn)一步探究。

總之，本試驗(yàn)首次應(yīng)用SELDI-TOF-MS技術(shù)研究奶牛乳熱血漿蛋白質(zhì)組學(xué)，成功預(yù)測(cè)了10種蛋白質(zhì)并發(fā)現(xiàn)其發(fā)生了改變，這可能與奶牛乳熱發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，這為今后深入研究這10種蛋白與奶牛乳熱發(fā)生的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

［1］Peter J.DeGaris，Ian J.Lean.Milk fever in dairy cows：a review of pathophysiology and control principles［J］.The Veterinary Journal，2008，176（1）：58-69.

［2］Roland Lehmann，Christian Melle，Niko Escher，et al.Detection and identification of protein interactions of S100 proteins by ProteinChip technology［J］.Journal of Proteome Research，2005，4（5）：1717-1721

［3］Daniel W.Coyne.Hepcidin:clinical utility as a diagnostic tool and therapeutic target［J］.Kidney International，2011，80（3）：240-244

［4］J Jackson，R B Sim，K Whaley，et al.Autoantibody facilitated cleavage of C1-inhibitor in autoimmune angioedma［J］.J Clin Incest，1989，83（2）：698-707.

［5］Gary O’Donovan，Edward Kearney，Roy Sherwood，et al.Fatness，fitness，and cardiometabolic risk factors in middle-aged white men［J］.Metabolism-Clinical and Experimental，2012，61（2）：213-220.

［6］Maureen S，Riedl，Patrick D.Braun，et al.Proteomic analysis uncovers novel actions of the neurosecretory protein VGF in nociceptive processing［J］.J Neurosci，2009，29（42）：13377-13388.

［7］Stephen R J Salton.Gian-Luca Ferri，Seung Hahm，et al.VGF：A novel role for this neuronal and neuroendocrine polypeptide in the regulation of energy balance［J］.Frontiers in Neuroendocrinology，2000，21（3）：199-219.

［8］Salazar A，Pintó X，Mana J，et al.Serum amyloid A and highdensity lipoprotein cholesterol：serum markers of inflammation in sarcoidosis and other systemic disorders［J］.European Journal of Clinical Investigation，2001，31（12）：1070-1077.

［9］Nevio Taglieri，Wolfgang Koenig，and Juan Carlos Kaski.Cystatin C and cardiovascular risk［J］.Clinical Chemistry，2009，55（11）：1932-1943.

Plasma Proteomics Analysis of Dairy Cows with Milk Fever Using SELDI-TOF-MS

SHU Shi，XIA Cheng，ZHANG Hong-you，XU Chu-chu，LI Chang-sheng，XIAO Xin-huan，WANG Gang
（College of Animal Science and Veterinary Medicine，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319，China）

Milk fever is an important metabolic disorder of dairy cows at calving.There have been many studies on the pathophysiology of milk fever，but the plasma proteomics of milk fever has not been reported.The aim of this study was to investigate novel changes in the plasma proteomics of cows with milk fever.Plasma samples were obtained from 21 Holstein cows with milk fever（T），and 59 control Holstein cows without milk fever（C）.24 differential peptide peaks in the plasma of T and C cows were isolated by SELDI-TOF-MS.10 of these peaks were identified by Swissport Protein Database.The petide peaks represented 10 unique proteins，and had significant alterations in peaks as determined.The up-regulated proteins were 4，and the down-regulated proteins were 2.The other proteins which were up-regulated as well as down-regulated were 4.In conclusion，we were able to use SELDI-TOF-MS to identify several novel plasma proteins in cows with milk fever.These findings may reveal new metabolitechanges in cows with milk fever.

SELDI-TOF-MS；plasma proteomics；milk fever；dairy cows

XIA Cheng

S858.23

A

0529-6005（2016）04-0016-03

2014-11-21

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目主任基金（30840060）；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（30972235）；黑龍江省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（C200916）

舒適（1986-），女，博士生，研究方向?yàn)榕R床獸醫(yī)學(xué)專業(yè)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)代謝病，E-mail：519296311@qq.com

夏成，E-mail：xcwlxyf@sohu.com