阿勒泰部分地區放牧馬梨形蟲病的流行病學調查

宋瑞其，王振寶，張　楊，李永暢，巴音查汗

（1.新疆農業大學動物醫學學院，新疆 烏魯木齊 830052；2.伊犁出入境檢驗檢疫局綜合技術服務中心，新疆 伊寧 835000）

阿勒泰部分地區放牧馬梨形蟲病的流行病學調查

宋瑞其1，王振寶2，張楊1，李永暢1，巴音查汗1

（1.新疆農業大學動物醫學學院，新疆 烏魯木齊 830052；2.伊犁出入境檢驗檢疫局綜合技術服務中心，新疆 伊寧 835000）

為了解阿勒泰部分地區放牧馬梨形蟲病的流行情況，筆者運用前期所建立的TaqMan探針實時熒光定量PCR方法結合傳統血涂片鏡檢方法，對吐爾洪鄉、克孜勒希勒克牧場及鐵買克鄉等3個地區的134匹放牧馬進行了馬梨形蟲病的流行病學調查；經FQ-PCR檢測得出，以上3個地區的感染率分別為36.96%，45.76%和31.03%，以克孜勒希勒克牧場最為嚴重；3個地區均以感染駑巴貝斯蟲為主；根據年齡段分析，幼駒的感染率高于成年馬匹。應用SPSS軟件分析得知，不同地區和不同年齡階段的馬匹感染梨形蟲病差異不顯著（P＞0.05）。結果表明，阿勒泰地區是馬梨形蟲病的流行地區。

馬梨形蟲病；實時熒光定量PCR；血涂片鏡檢法；流行病學調查

馬梨形蟲病（Equine piroplasmosis）是一種寄生于馬屬動物的淋巴細胞和紅細胞內的蜱源性傳染病，又稱馬焦蟲病、馬血孢子蟲病。病原分為馬泰勒蟲（Theileria equi）和駑巴貝斯蟲（Babesia caballi）。此病主要集中發生于2～6月份和9～11月份等兩個時間段。流行區域（自然疫源地）主要包括歐洲、非洲、亞洲、美洲等大部分熱帶及亞熱帶地區［1］，在我國的甘肅、青海、黑龍江、新疆等多個北方地區常有相關報道［2］。發病初期體溫呈間歇熱或不定熱型，精神不振，食欲減退，眼瞼水腫，隨繼出現貧血、黃疸、出血和呼吸困難等癥狀，若診斷和治療不及時，死亡率極高。為此筆者對阿勒泰隨機抽取了吐爾洪鄉、克孜勒希勒克牧場、鐵買克鄉等3個地區的無癥狀放牧馬匹進行梨形蟲病的檢測。旨在了解該地區馬梨形蟲感染情況，為阿勒泰地區的放牧馬群開展有效的馬梨形蟲病綜合防制工作提供可靠的依據。

1　材料與方法

1.1樣品來源134份放牧馬抗凝血樣品，于2014年7月份采自阿勒泰吐爾洪鄉（46份）、克孜勒希勒克牧場（59份）、鐵買克鄉（29份）等3個地區，并現場制作血涂片。

1.2樣品DNA提取取馬全血200 μL，用北京賽百盛基因技術有限公司提供的樹脂型TM基因組DNA提取試劑盒，進行馬全血DNA的提取（在高鹽狀態下，DNA純化樹脂專一性地吸附DNA；而在低鹽或水溶液狀態下，DNA被洗脫下來）。提取的全血DNA置-20℃保存備用。

1.3試劑與儀器瑞氏-姬姆薩復合染色液：Ⅰ液和Ⅱ液（參照參考文獻［3］）；樹脂型TM基因組DNA提取試劑盒（北京賽百盛基因技術有限公司）；10×PCR Buffer、dNTPs、MgCl2、Taq DNA聚合酶寶生物工程（大連）有限公司；ND-2000c型紫外分光光度計（美國Thermo sciencetific公司）；7500型熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。

1.4引物與探針駑巴貝斯蟲和馬泰勒蟲特異性引物及TaqMan探針均由本實驗室建立，由北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司合成。

1.5馬梨形蟲檢測方法

1.5.1血液涂片檢查將自然晾干的待染色血片水平放置，滴甲醇溶液至完全覆蓋血膜，使其固定，自然晾干。滴加I液3滴，使其蓋滿血膜，室溫在15℃左右時可染1 min，然后滴加Ⅱ液［3］6滴，輕輕搖動玻片與染液充分混合1.5 min后，用水沖去染液，待干后鏡檢。

1.5.2實時熒光定量PCR檢測以樹脂型TM基因組DNA提取試劑盒提取的馬全血DNA為模板，采用實時熒光定量PCR的方法進行目的片段的擴增。檢測馬泰勒蟲與駑巴貝斯蟲的反應體系為（25 μL）：10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，Mg2+2 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.75 μL，探針P 0.6 μL，rTaq DNA聚合酶 0.3 μL，加去離子水補至25 μL；反應條件為：95℃預變性2 min；95℃變性15 s，共40個循環；56℃退火50 s，每個循環退火延伸可收集熒光信號。

1.5.3統計學分析應用SPSS 19.0軟件對134份熒光定量PCR檢測全血樣本的數據，進行不同地區、不同年齡段、感染率之間的統計學分析。

2　結果與分析

2.1血液涂片檢查對阿勒泰地區采集的全血樣品進行血涂片鏡下觀察，吐爾洪鄉的46份血液中15份為陽性感染，感染率為19.57%，紅細胞的平均染蟲率為0.65%；克孜勒希勒克牧場的59份血液中14份為陽性感染，感染率為23.73%，紅細胞的平均染蟲率為0.70%；鐵買克鄉的29份血液中9份為陽性感染，感染率為31.03%，紅細胞的平均染蟲率為0.31%。馬梨形蟲分為馬泰勒蟲和駑巴貝斯蟲，在顯微鏡下蟲體多位于紅細胞的中央。馬泰勒蟲呈圓形、逗點狀；駑巴貝斯蟲典型的蟲體為雙梨形，以其尖端聯成銳角，每個蟲體有兩團染色質塊。在一個紅細胞內通常只有1～2個蟲體染蟲。紅細胞大部分較完整，有時出現空泡，呈圓盤狀，中間凹陷（見圖1）。

圖1　顯微鏡下觀察梨形蟲的部分結果

2.2實時熒光定量PCR檢查

2.2.1不同地區馬感染梨形蟲病的情況熒光定量PCR檢測結果顯示，陽性樣品出現了特異性的S形，陰性樣品未出現特異性擴增（見圖2）。

根據不同地區分析，吐爾洪鄉，克孜勒希勒克牧場和鐵買克鄉等3個地區放牧馬匹，經熒光定量PCR檢測馬梨形蟲的感染率分別為36.96%， 45.76%和31.03%，經傳統血涂片檢測的感染率分別為19.57%，23.73%和31.03%。由此可得，熒光定量PCR方法靈敏度高且檢出率明顯高于或等于血涂片鏡檢方法（見表1）。經統計學分析，不同牧場之間感染梨形蟲率差異不顯著（P＞0.05）。

2.2.2不同年齡段馬感染梨形蟲病的情況134份血液樣本經熒光定量PCR檢測后，不同年齡段的馬感染梨形蟲的情況見表2。

圖2　熒光定量PCR檢測梨形蟲的部分結果

表1　馬梨形蟲病檢查結果

表2　不同年齡段馬感染梨形蟲的情況

其中，駑巴貝斯蟲的總陽性率為26.87%（36/ 134），馬泰勒的總陽性率為18.66%（25/134），以感染駑巴貝斯蟲為主；按不同年齡分組進行比較，各年齡段的馬均可感染馬梨形蟲。在“＜1歲”與“4-6歲”兩個年齡段的感染率較高，分別為54.29%（19/35）和41.67%（5/12），幼駒相對易感。經SPSS軟件分析，不同年齡段對感染馬梨形蟲率的影響無顯著差異（P＞0.05）。見圖3。

3　討論

近年來，馬梨形蟲病的發病較為普遍，嚴重影響了畜牧業的發展，一直倍受國內外獸醫界關注。目前，馬梨形蟲病的診斷技術主要有根據臨床癥狀［4-6］和血涂片染色鏡檢［7］的常規診斷方法、免疫學方法［8-10］、普通PCR方法［11］等，其中實時熒光定量PCR方法是一種特異性、敏感性均較高的方法。因此，本次試驗采用實時熒光定量PCR方法對阿勒泰3個地區的放牧馬進行了梨形蟲病的檢測，以此提高檢測樣本的準確度。

圖3　不同年齡段馬感染梨形蟲的情況

通過本次試驗得出，FQ-PCR方法檢測的陽性率分別為36.96%，45.76%，31.03%。明顯高于血涂片鏡檢方法檢測的陽性率（19.57%，23.73%，31.03%）。為避免熒光定量PCR假陽性干擾，對鏡檢陰性而熒光定量PCR為陽性的樣品進行測序驗證。測序結果顯示，這些樣品均為駑巴貝斯蟲及馬泰勒蟲陽性。表明熒光定量PCR方法檢測結果并無假陽性干擾。對熒光定量PCR檢測的結果利用SPSS軟件分析得知不同牧場之間和不同年齡段之間，對感染馬梨形蟲病的影響均無顯著差異。3個地區中克孜勒希勒克牧場的感染率最高為45.76%；駑巴貝斯蟲病（26.87%）的感染率高于馬泰勒蟲（18.66%）；在不同年齡段中幼駒（54.29%）的感染率高于成年馬，幼駒較易感［5］。

馬梨形蟲病的傳播必須依賴硬蜱［12］，阿勒泰地區有著特殊的地理條件和豐富的草場資源，孳生的蜱蟲種類較多，放牧條件下馬匹極易受到蜱蟲侵擾，這給馬匹感染梨形蟲提供了有利條件。應對草場和圈舍采用超低容量噴霧進行滅蜱［12］，以從傳播途徑上阻斷梨形蟲的傳播。針對該地區無癥狀的馬匹（均為傳染源），熒光定量PCR方法可以靈敏、準確、快速檢測的馬梨形蟲感染與否。將分子診斷技術推廣、常規化，可以起到早期診斷的作用［13］。為進一步對該病的診治提供依據，望相關部門能對本病給予重視，以控制該病的繼續蔓延和向更加嚴重的趨勢發展。

［1］Bhoora R，Quan M，Paul T，et al.Sequence heterogeneity in the equi merozoite antigen gene（EMA-1）of Theileria equi and development of an EMA-1-specific TaqMan MGBTM assay for the detection of T.equi［J］.Vet Parasitol，2010，27（172）：33-45.

［2］謝俊仁，田占成，劉光遠，等.馬梨形蟲病的流行規律和診斷與檢測方法研究進展［C］.中國畜牧獸醫學會家畜寄生蟲學分會第六次代表大會暨第十一次學術研討會論文集，武漢：2011：88-92.

［3］高明巧.介紹改進的瑞氏一姬姆薩復合染色液［J］.錦州醫學院學報.1991，12（4）：246.

［4］劉家國，王德云，張帆，等.1例馬駑巴貝斯蟲病的診治［J］.畜牧與獸醫，2012，44（4）：104-105.

［5］潘漳海.馬巴貝斯蟲病的防治［J］.動物醫學，2013，4：45.

［6］張滿成.馬類家畜弩巴貝斯蟲病的診斷與防治［J］.農技服務，2007，24（9）：87.

［7］劉冰，于龍政，賈立軍，等.吉林省部分地區馬梨形蟲病的流行病學調查［J］.動物醫學進展，2005，26（9）：114-115.

［8］Ogunremi O，Georgiadis M P，Halbert G，et al.Validation ofthe indirect fluorescent antibody and the complement fixationtests for the diagnosis of Theileria equi［J］.Vet Parasitol，2007，148（2）：102-108.

［9］Salim B O，Hassan S M，Bakheit M A，et al.Diagnosis ofBabesia caballi and Theileria equi infections in horses in Su-dan using ELISA and PCR［J］.Parasitol Res，2008，103（5）：1145-1150.

［10］Asenzo G，Wilkowsky S，Barrandeguy M，et al.Developmentof an indirect ELISA for the diagnosis of equine piroplasmo-sis［J］.Ann N Y Acad Sci，2008，1149：235-238.

［11］楊存性，高琪，王祥榮，等.用單克隆抗體檢測瘧原蟲抗原的研究［J］.中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志，1987，5（4）：248-250.

［12］梁茂茂.蜱蟲的危害及防治［J］.吉林畜牧獸醫，2011，32（9）：43-45.

［13］蔣春燕，王泰健，王琴，等.實時熒光定量PCR技術［J］.動物醫學進展，2005，26（12）：97-101.

Epidemiological survey of Piroplasmosis in thegrazing horses in someparts Altay Prefectur

SONG Rui-qi1，WANG Zhen-bao2，ZHANG Yang1，LI Yong-chang1，BA Yinchahan1
（1.College of Animal Medicine，Xinjiang Agriculture University，Urumqi 830052，China；2.Yili Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Yining 835000，China）

To understand the epidemic situation of grazing horses infected with piroplasmosis from some areas in Altay region，a epidemiological survey was conducted to examine piroplasmosis using Taqman prode-based RTFQ-PCR method and microscopic examination of Giemsa-stained blood smears.Total A total of 134 random samples were detected.The results showed that the infection rate detected by RTFQ-PCR method in Tuerhong，Kezilexileke，and Tiemaike were 36.96%，45.76%，and 31.03%，respectively.The severest region for the infection of piroplasmosis was Kezilexileke.The infection rate of Babesia caballi was higher than that in Theileria equi.The infection rate in foals was higher than that in adult horses.There were no significant differences in horses infected with piroplasmosis from different areas and different ages（P＞0.05）.The survey confirms that Altay region is an epidemic region of piroplasmosis.

Equine piroplasmosis；Taqman prode-based RTFQ-PCR；microscopic examination of Giemsa-stained bloodsmears；molecular epidemiology

BA Yinchahan

S852.7

A

0529-6005（2016）04-0013-03

2015-04-09

國家自然科學基金-新疆聯合基金重點項目（U14-03283）；自治區產學研聯合培養研究生示范基地項目（xjaucxyyjs-20141003）

宋瑞其（1990-），男，碩士生，研究方向為預防獸醫學，E-mail：812084208@qq.com

巴音查汗，E-mail：bynch@hotmail.com