棘腹蛙TNF α基因的克隆與序列分析

羅　潔，賀明淑，袁萬安，樊汶樵，楊　帆，孫翰昌，徐敬明

（1.重慶文理學院林學與生命科學學院 重慶珍稀瀕危水產資源保護與開發研究中心，重慶 永川 402168；2.重慶電信職業學院，重慶 永川 402160）

棘腹蛙TNF α基因的克隆與序列分析

羅潔1，賀明淑2，袁萬安1，樊汶樵1，楊帆1，孫翰昌1，徐敬明1

（1.重慶文理學院林學與生命科學學院 重慶珍稀瀕危水產資源保護與開發研究中心，重慶 永川 402168；2.重慶電信職業學院，重慶 永川 402160）

為了解棘腹蛙TNFα基因的相關信息，對棘腹蛙的TNFα基因進行了克隆和序列分析。克隆了全長為936 bp、ORF長度為675 bp的TNFα-Pb基因；對該基因的蛋白質結構分析顯示，TNFα-Pb的信號肽由44個氨基酸組成，隨后由2個α螺旋，和10個β折疊形成小分子蛋白；系統進化分析發現，TNFα-Pb與兩棲類聚為一枝，與高等哺乳動物存在功能分化的可能。本研究為了解棘腹蛙的生物反應調節機制奠定了一定基礎。

棘腹蛙；腫瘤壞死因子α；克隆；序列分析

腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor，TNF）是一類介導免疫和炎癥反應，促進細胞的增值與分化的多功能細胞因子［1］。該基因由TNFA和TNFB組成，并分別編碼TNFα和TNFβ。其中，TNFα是由單核細胞和巨噬細胞產生的一種疏水性蛋白質，受體分布較廣；因其能夠選擇性地引起腫瘤組織壞死，因此受到人們的廣泛關注。人的TNFα基因長度約2.6 kbp，能夠通過與細胞膜上的特異受體結合參與細胞的生長、分化、凋亡、誘發炎癥甚至腫瘤疾病的治療［2］，有關TNFα信號通路的研究成為近十年生物醫學研究領域的熱點。近幾年，有研究TNFα可以通過激活下游信號轉導通路，實現調節免疫反應、細胞凋亡、炎癥應答以及腫瘤發生［3-4］。2015年初，中科院葛高翔等人分別解析了腫瘤壞死因子TNFα如何誘導癌細胞遷移和轉移［5］。

棘腹蛙（Paa boulengeri），屬于兩棲綱，無尾目，蛙科；是我國特有的廣泛分布于西南地區的土著大型蛙類。其體型碩大，肉質白嫩，能夠治療小兒虛瘦、產后或病后虛弱等癥，具有廣闊的市場前景。近年來，由于環境污染、氣候的異常變化、人類的大肆捕殺等多種因素造成其種群數量的驟減，已被《中國瀕危物種紅皮書》列為“易危”物種。本研究通過對棘腹蛙腫瘤壞死因子基因（TNFα-Pb）的克隆和生物信息學分析，為探索棘腹蛙的生物反應調節機制奠定理論基礎。

1　材料與方法

1.1試驗試劑和耗材2歲齡健康棘腹蛙，飼養于重慶珍稀瀕危水產資源保護與開發研究中心兩棲動物流水養殖系統。TRIZol、DEPC，購自上海生工生物工程技術服務有限公司；cDNA合成試劑盒、Taq酶、PCR純化試劑盒，購自Promega公司；凝膠回收試劑盒，購自OMEGA公司；Trans2K DNA Marker，購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2特異引物的設計根據其轉錄組數據庫，利用Primer5.0軟件設計基因特異性引物，包括上游引物：5′-TGGACAAACCAACAGCAAACACACA-3′，下游引物：5′-AAGAACGTGAGCCGATGGAAAAACA-3′；由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.3棘腹蛙TNFα-Pb基因序列獲得取棘腹蛙組織制備cDNA模板，并利用高保真DNA Taq酶進行特異基因的擴增，陽性產物交蘇州金唯智生物科技有限公司測序。

1.4生物信息學分析使用SignalP 3.0，TMHMM，DNASTAR，SMART和Swissprot軟件分別進行信號肽、跨膜域、同源比對、功能結構分析。利用MEGA 5.0軟件以鄰近法（Neighbor-Joining）取500次重復構建系統進化樹。

2　結果與討論

2.1TNFα-Pb基因的克隆根據棘腹蛙轉錄組數據庫檢索發現1個注釋為TNFα-Pb的基因，利用RTPCR克隆了其全長序列。結果如圖1所示，包括兩端UTR區的TNFα-Pb基因總長為936 bp，其中包含1個675 bp的ORF，編碼224個氨基酸，蛋白質理論分子量為25.08 kDa，等電點為7.16。

圖1　TNFα-Pb的基因擴增及序列分析

2.2棘腹蛙TNFα-Pb的蛋白結構特征從中插彩版圖2結果顯示，棘腹蛙TNFα-Pb的二級結構顯示，整個蛋白可能存在α螺旋的區域為氨基酸序列的24-48位和67-68位可能的β折疊區域分別為氨基酸序列的4-5位，88-95位，100-105位，116-119位，122-125位，131-139位，151-158位，184-194位，199-203位和217-223位。其中，1-44位存在信號肽，88-224位為保守的功能域。而以人的TNFα（3ALQ_A）為模板，利用Swissprot軟件預測TNFα-Pb的三維結構可直觀看出，棘腹蛙的TNFα-Pb為小分子蛋白，主要由2個α螺旋和10個β折疊組成，結構相對簡單。

2.3TNFα-Pb的進化根據GenBank中搜索到113條TNFα-Pb的同源序列，利用鄰接法構建遺傳進化樹。結果顯示（圖3），TNFα-Pb與兩種爪蟾Xenopus laevis和Xenopus（Silurana）tropicalis聚為一簇，而后與脊索動物門的矛尾魚親緣關系較近，并與爬行類、哺乳類和鳥類形成不同分支，說明TNFα的進化相對穩定，為其起源和功能分化再一次提供了補充依據。

3　結論與討論

腫瘤壞死因子α（TNFα）是由單核巨噬細胞產生，具有免疫應答、炎癥反應、修復細胞損傷、參與細胞凋亡等生物學功能［6］，多在生物損傷和全身炎癥反應綜合征過程中發揮主要功能［7］。簡單說來，TNFα一方面是機體的免疫防護的重要介質，例如，正常水平的TNFα主要作為炎癥介質而作為疾病危重階段的輔助診斷指標。另一方面可參與機體的免疫病理損傷，是免疫性疾病的發病的臨床監測對象，例如，TNFα的高量表達可引發組織細胞損傷，被公認為是抗炎癥和抗腫瘤作用最強的細胞因子［8］。但是，TNFα的功能分化機制至今尚未見報道。

圖3　TNFα-Pb的系統進化樹構建

本研究是基于對棘腹蛙的轉錄組數據分析過程中，首次鑒定到該物種的TNFα-Pb及其編碼蛋白質的序列特征，并通過一系列分析為研究TNFα的功能分化提供了理論依據。序列特征分析結果顯示，相較于人的TNFα，盡管二者在兩端的非翻譯區同樣具有相對保守的AU富含元件，但棘腹蛙的TNFα-Pb的功能序列均更短，并且TNFα-Pb前體由223個氨基酸組成（25.08 kDa），其中包含44個氨基酸殘基的信號肽。對應的蛋白質的三維結構也更加簡單，主要為2個短的α螺旋和10個β折疊形成的β夾心結構。鑒于有報道稱人的TNFα缺失N端2個氨基酸（Val、Arg）具有更好的生物學活性和抗腫瘤效應。因此，我們推測棘腹蛙TNFα-Pb與人TNFα的功能存在較大差異。通過鄰接法構建的系統進化結果顯示，TNFα-Pb的進化相對穩定，有意思的是，狐蝠科的3種蝙蝠與小耳大嬰猴聚為一枝，并且與馬屬TNF-α近緣，其中前者置信值為51，視為親緣較近，暗示該基因存在趨同進化趨勢，并且存在功能分化的可能。因此，深入挖掘棘腹蛙TNFα-Pb的功能將有助我們進一步解析腫瘤壞死因子的分化歷程，為闡釋其生物學功能機制奠定基礎。

［1］Tartaglia L A，Goeddel D V.Two TNF receptors［J］.Immunology today，1992，13：151-153.

［2］Tracey K J，Cerami A.Tumor necrosis factor:a pleiotropic cytokine and therapeutic target［J］.Annual review of medicine，1994，45：491-503.

［3］Liu J，Yan J，Jiang S，et al.Site-specific ubiquitination is required for relieving the transcription factor Miz1-mediated suppression on TNF-alpha-induced JNK activation and inflammation［J］.PNAS，2012，109：191-196.

［4］Yan J，Xiang J，Lin Y，et al.Inactivation of BAD by IKK inhibits TNFalpha-induced apoptosis independently of NF-kappaB activation［J］.Cell，2013，152：304-315.

［5］Xia P，Zhang R，Ge G C.EBPbeta Mediates TNF-alpha-Induced Cancer Cell Migration by Inducing MMP Expression Dependent on p38 MAPK［J］.Journal of cellular biochemistry，2015，116：2766-2777.

［6］Chen J W，Chen Y H，Lin S J.Long-term exposure to oxidized low-density lipoprotein enhances tumor necrosis factor-alphastimulated endothelial adhesiveness of monocytes by activating superoxide generation and redox-sensitive pathways［J］.Free radical biology medicine，2006，40：817-826.

［7］Wilson M R，Choudhury S，Takata M.Pulmonary inflammation induced by high-stretch ventilation is mediated by tumor necrosis factor signaling in mice［J］.American journal of physiology Lung cellular and molecular physiology，2005，288：599-607.

［8］Murano M，Maemura K，Hirata I，et al.Therapeutic effect of intracolonically administered nuclear factor kappa B（p65）antisense oligonucleotide on mouse dextran sulphate sodium（DSS）-induced colitis［J］.Clinical and experimental immunology，2000，120：51-58.

Molecular cloning and analysis of Tumor Necrosis Factor alpha（TNFα）fromPaa boulengeri

LUO Jie1，HE Ming-shu2，YUAN Wan-an1，FAN Wen-qiao1，YANG Fan1，SUN Han-chang1，XU Jing-ming1
（1.College of Life Science&Forestry Chongqing University of Art&Science Chongqing Chongqing Research Centers of Conservation and Development on Rare&Endangered Aquatic Resources，Chongqing 402168，China；2.Chongqing electronic information college，Chongqing 402160，China）

Tumor necrosis factor alpha（TNFα）is a cytokine involved in immune regulation，apoptosis，and inflammation pathways.Here，we studied the sequence feature，protein structure and phylogenic characteristic of TNFα from Paa boulengeri，The results showed that，TNFd-pb gene was 936 bp in length and the protein structure of TNFα-Pb was a small molecular protein that consisted of 44 amino acid length of signal peptide，two alpha helixes and ten beta sheets.And the phylogenic analysis showed that TNFα-Pb was in the cluster with other amphibian but may have different functions when compared with mammals.Hence，this study may lay the foundation to reveal the immune-regulation mechanism of Paa boulengeri in future.

Paa boulengeri；Tumor Necrosis Factor alpha（TNFα）；Cloning；Sequence analysis

YANG Fan

R 394.2

A

0529-6005（2016）04-0009-04

2015-11-26

重慶市科技計劃重點專項（cstc2015jcyjBX0013）；重慶市科技計劃項目（cstc2014jcyjA80042）；重慶市教委科學技術研究項目（KJ1401105）；重慶文理學院人才引進項目（R2013LS13，R2014LX07）

羅潔（1983-），女，講師，博士，從事比較基因組學研究，E-mail：eijoul@sina.cn

楊帆，E-mail：yfan4103@163.com