注射用丹參多酚酸對腦缺血大鼠VEGF、IL-10的影響

白　蓉，　王　淑

?

注射用丹參多酚酸對腦缺血大鼠VEGF、IL-10的影響

白蓉，王淑

目的觀察丹參多酚酸注射液對腦缺血大鼠VEGF、IL-10表達的影響，探討丹參多酚酸的腦保護作用及機制。方法采用線栓法建立大鼠左側大腦中動脈梗死模型，SD大鼠隨機分為假手術組(Sham組)、模型組(MCAO組)、丹參多酚酸治療組(治療組)，按缺血時間分為4個亞組(6 h、12 h、24 h、48 h)，采用Longa法評估大鼠神經行為學，ELISA法測定血清VEGF、IL-10的含量，HE染色法觀察神經元形態，免疫組化法、Western blot法檢測大鼠腦組織VEGF、IL-10的表達。結果(1)Sham組神經行為學評分為0；治療組與MCAO組相比，丹參多酚酸可以明顯降低大鼠神經行為學評分(P<0.05)。(2)與Sham組相比，MCAO組與治療組血清VEGF、IL-10含量均升高(P<0.05)，但治療組升高更顯著(P<0.05)。(3)MCAO組、治療組缺血半暗區皮質神經元均較Sham組少，治療組較MCAO組神經元數目明顯增多；Sham組可見少量VEGF、IL-10表達，治療組在各個時間點VEGF、IL-10的表達均較MCAO組增多(P均<0.05)。結論丹參多酚酸增強大鼠腦缺血后VEGF、IL-10的表達，可能是其保護腦細胞機制之一。

丹參多酚酸；腦缺血；血管內皮生長因子；白細胞介素-10

缺血性腦血管病具有高致殘率、高死亡率、高復發率，極大危害人類健康，如何減輕缺血后的神經損傷成為臨床治療的重點。腦缺血發生后，缺血半暗區會產生大量血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等與血管新生有關的生長因子，促進血管的新生。[1]炎癥反應也是腦缺血損傷的重要機制之一，白細胞介素-10(IL-10)是抗炎細胞因子，在腦缺血后發揮重要的神經保護作用[2]。丹參是經典而傳統的中藥材，作為治療缺血性腦損傷藥物已經廣泛應用于臨床。丹參多酚酸(Salvianolate)為丹參的水溶性提取物，在治療大鼠局灶性腦缺血方面具有顯著療效，可通過降低大鼠腦組織缺血面積，細胞氧化損傷，抑制炎性細胞浸潤，達到治療急性腦缺血目的[3]。但其對大鼠腦缺血后VEGF、IL-10的表達的影響尚少見報道，本研究通過ELISA法、HE染色法、免疫組化法及Western blot方法檢測VEGF、IL-10的表達情況，以闡明丹參多酚酸對腦缺血的神經保護機制。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物及分組健康雄性SD大鼠120只(體重250～280 g)，清潔級，由鄭州大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(豫)2010-0002。隨機分為假手術組(Sham組)、模型組(MCAO組)、丹參多酚酸治療組(治療組)，再按缺血時間隨機分為6 h、12 h、24 h、48 h 4個亞組，每個亞組10只，5只用來做組織學染色，5只用來做Western blot蛋白檢測。

1.1.2試劑及儀器注射用丹參多酚酸(天津天士力之驕藥業有限公司，批準文號為國藥準字Z20110011，規格為每支裝0.13 g)；ECL化學發光試劑盒(康為世紀)；兔抗大鼠VEGF、IL-10抗體(Abcam公司)；山羊抗兔IgG-FITC(康為世紀)；VEGF的ELISA試劑盒(上海巧伊公司)；IL-10的ELISA試劑盒(美國 raybiotech公司)；石蠟切片機；熒光顯微鏡(BX50 Olympus)；Leica 顯微成像系統(德國萊爾公司)；酶聯免疫檢測儀(美國Sat公司)；電泳儀、轉膜儀(北京六一儀器廠)。

1.2方法

1.2.1動物模型建立及給藥途徑采用改良Longa法制備大鼠左側大腦中動脈閉塞模型[4，5]。SD大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)麻醉成功后取仰臥位，頸部正中切口，依次分離頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈，結扎頸總動脈并掛線備用，結扎頸外動脈，動脈夾暫夾閉頸內動脈，在頸總動脈靠近分叉處剪一小口，將線栓插入頸內動脈，去掉動脈夾，緩慢插入至有阻力時停止進線，深度約18mm，扎緊備線，消毒，縫合，術后保溫。Sham組除了不結扎血管其余步驟同模型組。大鼠清醒后治療組腹腔注射已被0.9%氯化鈉注射液稀釋后的丹參多酚酸30 mg/kg，MCAO組、Sham組給予等量的生理鹽水。

1.2.2神經功能學評分手術大鼠清醒后按Longa法[6]對大鼠神經行為評分，0分：無神經功能缺損；1分：不能完全伸直右側前爪；2分：向右側轉圈；3分：向右側傾倒；4分：不能自發行走，意識喪失。1～3分為成功造模。

1.2.3ELISA法測定腦缺血大鼠血清VEGF、IL-10含量于各時間點取大鼠上腔靜脈血，4 ℃離心取上清，分別按VEGF、IL-10檢測試劑盒(酶聯免疫吸附實驗雙抗夾心法)檢測，具體方法按說明書操作。

1.2.4HE染色法觀察腦缺血大鼠組織學形態變化大鼠分別于缺血6 h、12 h、24 h、48 h后經多聚甲醛灌注固定后斷頭取腦，進行石蠟包埋，切片，厚度約5 μm，常規脫蠟水化，蘇木精染色，酸化伊紅乙醇復染，常規脫水、透明、中性樹膠封片。顯微鏡下觀察皮質區神經元形態。

1.2.5免疫組化法檢測大鼠腦內VEGF、IL-10蛋白表達取上述石蠟切片，脫蠟修復，分別一抗、二抗孵育，DAB染色，中性樹膠封片，每張圖片在缺血半暗帶皮質區隨機選取5個不同高倍視野，計數陽性細胞數。

1.2.6Western blot檢測VEGF、IL-10蛋白動物模型制備后各時間點，將大鼠麻醉后取左側缺血區皮質腦組織，冰上進行蛋白裂解及研磨，離心取上清，BCA法測定蛋白濃度，上樣、電泳，轉至硝酸纖維素膜上，脫脂奶粉封閉，一抗孵育4 ℃過夜，二抗室溫孵育2 h，在暗室曝光顯影。所得圖像用Image J圖像處理軟件分析，以目的蛋白與內參吸光度的比值即為目的蛋白相對值。

2　結　果

2.1大鼠神經行為變化Sham組神經功能缺損評分為0分；治療組與MCAO組相比，腦缺血后6 h、12 h神經功能無明顯差異(P>0.05)，24 h、48 h神經功能改善明顯，差異有統計學意義(P<0.05)(見表1)。

2.2VEGF、IL-10的ELISA結果Sham組血清VEGF、IL-10含量少，MCAO組與治療組均較Sham組高(P<0.05)，治療組與MCAO組相比，血清VEGF、IL-10水平均升高(P<0.05)(見表2、表3)。

2.3腦缺血大鼠形態學觀察Sham組大鼠腦組織結構完整，神經元細胞排列緊密，胞核染色清晰，胞質均勻(見圖1A)。缺血后梗死灶周圍神經元細胞變性壞死，胞核固縮，胞質不均勻(見圖1B～I)。各個時間點，可以看出治療組均較MCAO組正常的神經元細胞數目增多。

2.4VEGF、IL-10蛋白的表達情況Sham組大鼠腦組織 VEGF、IL-10僅少量表達。MCAO組、治療組VEGF、IL-10的表達6 h時開始升高，24 h達到高峰，48 h稍有下降(見圖2～圖4)。各個時間點治療組與MCAO組比較明顯升高(P<0.05)(見表4～表7)。

表1　大鼠神經行為學評分[n=5，M(Q)]

用秩和檢驗，MCAO-SLI組與MCAO組比較*P<0.05

表2　各組大鼠血清VEGF濃度(pg/ml)的比較

與Sham組比較*P<0.05；與MCAO組比較△P<0.05

表3　各組大鼠血清IL-10濃度(pg/ml)的比較

與Sham組比較*P<0.05；與MCAO組比較△P<0.05

表4　各組大鼠VEGF陽性細胞數比較

與Sham組比較，*P<0.05；與MCAO組比較，△P<0.05

表5　各組大鼠IL-10陽性細胞數比較

與Sham組比較*P<0.05；與MCAO組比較△P<0.05

表6　各組大鼠VEGF的相對灰度值比較

與Sham組比較*P<0.05；與MCAO組比較△P<0.05

表7　各組大鼠IL-10的相對灰度值比較

與Sham組比較*P<0.05；與MCAO組比較△P<0.05

圖1　各組大鼠形態學所見

圖2　各組大鼠VEGF表達情況

圖3　各組大鼠IL-10表達情況

1、2、3、4：Sham組6 h、12 h、24 h、48 h；5、6、7、8：MCAO組6 h、12 h、24 h、48 h；9、10、11、12：治療組6 h、12 h、24 h、48 h

圖4各組大鼠缺血腦組織VEGF、IL-10的表達

3　討　論

VEGF最初被發現是一種血管生長和血管滲透因子，參與神經保護、抗炎過程、神經突觸增生及缺血大腦重塑[7，8]。Yang等[9]采用大腦中動脈閉塞的局灶性腦缺血再灌注兔模型，在缺血2 h后顱內顯微鏡下注射不同劑量(低劑量：1.25 ng/μl，中劑量：2.5 ng/μl，高劑量：5.0 ng/μl)VEGF，觀察兔腦梗死體積、含水量及神經功能缺損變化，發現中劑量(2.5 ng/μl)組明顯降低腦梗死體積、腦組織含水量及改善神經行為功能，發揮神經保護作用，低劑量組、高劑量組腦梗死體積與生理鹽水對照組無明顯差異，低劑量組腦組織含水量及神經行為功能與生理鹽水對照組相比無明顯差異。脊髓損傷大鼠模型中在其損傷24 h后，病灶中心處注射人重組VEGF165發現IL-1β，TNF-α，IL-10的水平下調，促進大鼠神經行為功能恢復，減少運動神經元的丟失，表明VEGF可通過抑制炎癥反應從而抑制脊髓損傷[10]。在VD大鼠通過外源性給予VEGF利用電生理學技術，記錄大鼠海馬CA1區的長時程增強(long-term potentiation，LTP)，發現VEGF明顯升高VD大鼠的LTP，改善突觸可塑性的降低[11]。Hayashi[12]利用cDNA序列等方法觀察血管生長相關基因表達，研究了96個與血管新生相關的基因，發現42個(43.8%)，29個(30.2%)和13個(13.5%)基因分別在1 h、1 d、21 d增加，在腦缺血后24 h即出現增值的內皮細胞，3 d后血管數目增加，這意味著在腦缺血損傷后立即發生血管生成。

腦缺血損傷包括一系列復雜的病理生理過程，其中炎癥反應在缺血中所引發的繼發性腦損傷中起著關鍵作用。IL-10是由活化的單核細胞、T細胞等分泌的高活性多功能蛋白多肽分子，參與機體的免疫調節，是重要的抗炎細胞因子之一。Griui 等[13]使用IL-10基因敲除小鼠，在腦梗死24 h后，其腦梗死體積較MCAO小鼠腦梗死體積大30%；研究擴展至體外模型，與來源于野生型小鼠的神經元原代細胞相比，來源于IL-10基因敲除小鼠的神經元原代細胞對興奮性毒性及氧-糖剝奪更敏感；結合體內及體外實驗數據，表明外源性及內源性的IL- 10在腦缺血時都具有神經保護作用。

近年來，關于中藥在急性腦缺血損傷的治療方面研究非?；钴S，丹參的應用尤其廣泛，丹參多酚酸是丹參水溶性有機酸，可通過血腦屏障，主要通過以下幾個途徑改善腦缺血：(1)增加缺血區腦血流量；(2)抗血小板聚集作用，對凝血系統無影響，無出血風險；(3)抗氧化、清除自由基作用；(4)對缺氧引起的線粒體損傷有顯著的保護作用；(5)參與調節細胞內鈣濃度，抑制細胞凋亡[14～17]。He等[18]通過對1型糖尿病MCAO大鼠腦缺血24 h后通過尾靜脈注射丹參多酚酸，每天1次并持續14 d，發現VEGF、BDNF的表達增加以及上調BDNF-TrkB-CREB信號通路，減小梗死體積，從而促進I型糖尿病MCAO大鼠腦缺血后神經功能恢復。

關于丹參多酚酸在腦缺血早期抗炎及血管保護方面的國內外研究尚少見。本實驗應用丹參多酚酸作為治療腦缺血損傷的藥物，采用左側大腦中動脈閉塞模型，選取腦缺血6 h、12 h、24 h、48 h 4個時間點從血管保護及抗炎的角度闡明其腦保護作用，結果發現腦缺血大鼠通過丹參多酚酸干預后，各個時間點治療組血清及腦組織VEGF、IL-10表達水平明顯高于MCAO組，且呈動態變化，6 h少量表達，12 h繼續增高，24 h達高峰，48 h稍下降但仍處于較高水平，減少神經元凋亡數，有效的改善大鼠神經行為學功能。由此推測丹參多酚酸在缺血性腦血管病早期通過增強VEGF的表達發揮血管保護作用，通過增強IL-10的表達發揮抗炎作用，減輕腦水腫，促進神經功能恢復，為闡明丹參多酚酸治療腦缺血提供新的理論依據和治療思路。

[1]Liman TG，Endres M. New vessels after stroke：postischemic neovascularization and regeneration[J]. Cerebrovasc Dis，2012，33：492-499.

[2]李科，劉健，任紅英，等. 白細胞介素-10對腦梗死再灌注大鼠p53AIP1蛋白表達的影響[J]. 中國醫藥生物技術，2010，5(4)：264-265.

[3]崔佩佩. 注射用丹參酚酸治療缺血性中風的物質基礎及作用機制研究[D]. 天津：南開大學，2011.

[4]Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rat[J]. Stroke，1989，20：84-91.

[5]Engel O，Kolodziej S，Dirnagl U，et al. Modeling stroke in mice-middle cerebral artery occlusion with the filament model[J]. J Vis Exp，2011，1(47)：3791-2423.

[6]Bederson JB，Pitts LH，Miles T，et al. Rat middle cerebral artery occlusion：evaluation of the model and development of a neurologic examination[J]. Stroke，1986，17(3)：472-476.

[7]Senger DR，Galli SJ，Dvorak AM，et al. Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid[J]. Science，1983，219(4587)：983-985.

[8]Greenberg DA，Jin K. Vascular endothelial growth factors (VEGFs) and stroke[J]. Cell Mol Life Sci，2013，70(10)：1753-1761.

[9]Yang JP，Guo L，Liu RC，et al. Neuroprotective effects of VEGF administration after focal cerebralischemia/reperfusion：Dose response and time window[J]. Neurochem Int，2012，60(6)：592-596.

[10]Wang HY，Wang YS，Li DD，et al. VEGF inhibits the inflammation in spinal cord injury through activation of autophagy[J]. Biochemi Biophys Res Commun，2015，462(2)：453-458.

[11]楊佳佳. 外源性VEGF對腦缺血模型大鼠認知能力的保護作用及機制探究[D]. 天津：南開大學，2014.

[12]Hayashi T，Noshita N，Sugawara T，et al. Temporal profile of angiogenesis and expression of related genes in the brain after ischemia[J]. J Cereb Blood Flow Metab，2003，23(2)：166-180.

[13]Griui M，Barbjeri I，Basudev H，et al . Interleukin- 10 modulates neuronal threshold of vulnerability to ischemic damage [J] . Eur J Neurosci，2000，12(7)：2265- 2272.

[14]Zhang HG，Gao M，Zhang L，et al. Salvianolic acid A protects human SH-SY5Y neuroblastoma cells against H2O2-induced injury by increasing stress tolerance ability[J]. Biochem Biophys Res Commun，2012，421(3)：479-483.

[15]Wang SB，Pang XB，Zhao Y，et al. Protection of salvianolic acid A on rat brain from ischemic damage via soluble epoxide hydrolase inhibition [J]. J Asian Nat Prod Res，2012，14(11)：1084-1092.

[16]杜冠華，張均田. 丹酚酸A對小鼠腦缺血再灌注致學習記憶功能障礙的改善作用及作用機制[J]. 藥學學報，1995，30(3)：184-190.

[17]張均田. 丹酚酸B防治神經退行性疾病的研究進展 [J]. 醫藥導報，2007，26(2)：107-110.

[18]He QS，Wang SX，Liu XL，et al. Salvianolate lyophilized injection promotes post-stroke functional recovery via the activation of VEGF and BDNF-TrkB-CREB signaling pathway in T1DM-MCAO rats[J]. Int J Clin Exp Med，2015，8(1)：108-122.

The effect of Salvianolate on expression of VEGF、IL-10 after focal cerebral ischemia injury in rats

BAIRong，WANGShu.

(DepartmentofNeurology，InstituteofClinicalMedicine，TheFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052，China)

ObjectiveTo investigate the effect of Salvianolate on the expression of vascular endothelial growth factor(VEGF)、IL-10 in rats with cerebral ischemia injury，and to further explore the mechanism and neuroprotection of Salvianolate. MethodsThe left middle cerebral artery occlusion(MCAO) rats models were established by Longa method. SD rats were randomly divided into three groups：sham group，MCAO group，salvianolate group. According to different ischemia time，each group was divided into 4 subtypes(6 h、12 h、24 h、48 h). The rat neurobehavioral score was evaluated by Longa’s test. The concentration of VEGF、IL-10 in serum were detected by ELISA. HE staining was used to observe the morphological structure of cortical neurons. The expressions of VEGF、IL-10 were detected by immunohistochemistry and Western blot. Results(1)The neurobehavioral score of sham group was 0.Compared with MCAO group，salvianolate could obviously reduce the behavior score in rats. (2)Compared with sham group，the concentration of VEGF、IL-10 in serum increased in MCAO group and increased obviously in salvianolate group. (3)The number of neurons in MCAO group and salvianolate group were significantly decreased than in sham group. Compared with MCAO group，the number of neurons was increased in salvianolate group. A little expression of VEGF、IL-10 could be seen on cerebral cores in sham group. The expression of VEGF、IL-10 in salvianolate group were higher than MCAO group at different time points. ConclusionSalvianolate could enhance the expression of VEGF、IL-10 after ischemia in rats. This perhaps was one of the important protective mechanisms.

Salvianolate；Middle cerebral artery occlusion(MCAO)；Vascular endothelial growth factor(VEGF)；Interleukin-10(IL-10)

1003-2754(2016)05-0411-06

2016-01-25；

2016-04-23

(鄭州大學第一附屬醫院神經內一科，河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室，河南 鄭州 450052)

白蓉，E-mail：bai13838169212@163.com

R743.3

A