肝細胞性肝癌中磷酸化PED/PEA-15和P-p27T187的表達及臨床意義

吳益峰，朱柯磊，陳磊，王靜文，蔣存兵，李定耀，陳明良

肝細胞性肝癌中磷酸化PED/PEA-15和P-p27T187的表達及臨床意義

吳益峰，朱柯磊，陳磊，王靜文，蔣存兵，李定耀，陳明良

目的探討磷酸化蛋白PED/PEA-15（s-116）和P-p27T187在肝細胞性肝癌中的表達，揭示兩者在肝細胞肝癌發生發展及轉移中的可能作用機制。方法應用免疫組織化學和Western印跡檢測40份（40例患者）肝細胞性肝癌和相應癌旁組織（距離腫瘤邊緣2 cm以外）及12份（12例患者）正常肝組織中PED/ PEA-15（s-116）和P-p27T187的表達，分析其與臨床病理特征的關系，并采用Spearman秩相關法分析兩者之間的相關性。結果肝細胞性肝癌組織中PED/PEA-15（s-116）和P-p27T187蛋白的表達均明顯高于癌旁組織和正常肝組（均P＜0.05）。PED/PEA-15（s-116）、P-p27T187的表達與病理分級、臨床分期及有無門靜脈癌栓均有關（均P＜0.05）；而與發病年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤數目及甲胎蛋白（AFP）水平等均無關（均P＞0.05）。PED/PEA-15（s-116）和P-p27T187蛋白在肝細胞性肝癌中的表達呈正相關（r=0.056，P＜0.05）。結論PED/PEA-15（s-116）和P-p27T187在肝細胞肝癌中呈高表達，與肝癌的發生、發展及轉移相關并有可能成為肝細胞性肝癌基因治療的新靶點。

腫瘤；肝細胞性癌；PED/PEA-15（s-116）；P-p27T187

［Modern Practical Medicine，2016，28（9）:1134-1138］

肝細胞性肝癌（HCC）是惡性程度極高、預后極差的惡性腫瘤之一［1-2］，目前對其發生、發展、轉移和復發的精確分子機制尚不完全清楚。PED/PEA-15是一種廣譜抗凋亡蛋白質，在腫瘤的形成過程中發揮著重要的作用，其通過調控凋亡關鍵因子［如天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶（caspases）］介導的信號傳導通路而阻斷凋亡途徑，從而抑制細胞凋亡，促進細胞增殖。p27蛋白屬于細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子（CDKI）家族成員，參與調節細胞增殖、凋亡及分化等，p27的磷酸化可導致細胞內p27蛋白水平下降，引發細胞周期調控紊亂并促進細胞異常增殖，抑制細胞的凋亡［3］。本研究采用免疫組織化學及Western免疫印跡研究磷酸化PED/PEA-15和P-p27T187在肝細胞性肝癌的表達情況，對比研究兩者的相關性，分析揭示其肝細胞肝癌發生、發展、轉移和復發中的可能作用機制?，F將結果報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料收集寧波大學醫學院附屬鄞州醫院2012年10月至2015年12月手術切除的40份（40例患者）HCC組織及相應的癌旁組織（距腫瘤邊緣2 cm以外，切緣經病理證實未見癌細胞），其中男25例，女15例；年齡30～71歲，平均（47.6±10.0）歲。按照Edmondson分級標準：Ⅰ級10例，Ⅱ級12例，Ⅲ級15例，Ⅳ級3例；高中分化21例，低分化19例。所有病例均經術后病理學證實，術前未接受放療、化療等干預措施。另收集同期肝血管瘤旁和肝外傷正常肝組織12份（12例患者）作為正常對照組。標本采集后立即將組織塊用0.9%氯化鈉注射液進行反復清洗，以去除血液，并盡可能剪去多余的其他組織，置于-80℃冰箱保存。標本采集均通過倫理委員會討論同意。

1.2主要試劑及材料兔抗人多克隆抗體PED/ PEA-15（s-116）和P-p27T187購于美國santaCrus公司，兔抗人多克隆抗體actin購于美國santaCrus公司，山羊抗兔二抗購于美國santaCrus公司。免疫印跡化學發光試劑（ECL）購于上海碧云天生物技術有限公司。蛋白質電泳與電轉移裝置（美國Bio-Rad公司）。

1.3方法

1.3.1免疫組織化學定位和半定量檢測PED/ PEA-15（s-116）和P-p27T187的表達標本經4%中性甲醛固定，常規石蠟包埋，切片厚0.4m，常規HE染色，光鏡下行細胞形態學觀察，確定病理診斷、分組及細胞定位。免疫組化染色采用Elivison二步法檢測PED/PEA-15（s-116）和P-p27T187表達情況，按試劑盒說明操作。以PBS代替一抗、二抗做陰性對照。

1.3.2Western免疫印跡定量檢測PED/PEA-15（s-116）和P-p27T187的表達取約50mg組織液氮研磨后，加入1 ml預冷組織裂解液（10 mmol/L Tris-HCl，1%Triton X-100，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L EGTA，1 mmol/L PMSF，65 mmol/L DTT，30 mol/L焦磷酸鈉，50 mmol/L NaF，1 mmol/L Na3VO4，2% CocKtail），冰上靜置1h，4℃低溫12000轉離心30min，取上清液，考馬斯亮蘭法測定蛋白濃度。取10g蛋白樣品加入1/4樣品體積的5×上樣緩沖液，100℃煮5min變性后，結合臨床資料按因素進行實驗分組并分別進行實驗，嚴格控制實驗誤差在有效范圍內。行12%聚丙烯酰胺凝膠（SD-PAGE）電泳分離蛋白質，電轉移法將蛋白質轉移到NC膜，用含5%脫脂牛奶的TBS封閉2h，加入一抗（P-p27T187以1∶300稀釋），4℃冰箱中過夜，TBST液洗膜15 min×3次，加入二抗中（1∶5 000稀釋），反應1 h，TBST洗膜15min×3次后作ECL化學發光，X片（Kodak）曝光顯影，利用凝膠成像儀灰度分析軟件QuantityOne進行光密度值分析測定目的顯影條帶和內參照Actin的光密度OD值，結果以比值（樣本光密度OD值/內參光密度OD值）表示。

1.4免疫組化結果判定PED/PEA-15（s-116）和P-p27T187在免疫組化中的陽性表達體現為細胞內棕黃色顆粒樣物質的沉積，根據顯色強度判斷其陽性程度：標本無色為0分；淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕黑色、棕褐色為3分。根據陽性細胞數在觀察細胞中所占的比例分為：無陽性細胞為0分；陽性細胞數≤10%為1分；11%～50%為2分；51%～75%為3分；＞75%為4分。染色強度與陽性細胞百分比的乘積＞3分為陽性［4］。

1.5統計方法采用SPSS17.0統計分析軟件進行數據分析和統計學處理，率的比較采用2檢驗；計量資料以均數±標準差表示，兩組比較用t檢驗，指標之間用Spearman秩相關法進行相關性分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1HCC/癌旁組織及正常肝組織中PED/PEA-15（s-116）、P-p27T187表達PED/PEA-15（s-116）、P-p27T187蛋白陽性表達均定位于細胞質內，為粗細不一的棕黃色顆粒樣物質（封三彩圖1～2）。40份HCC組織中PED/PEA-15（s-116）（29份，72.5%）和P-p27T187（31份77.5%）的陽性表達率均明顯高于癌旁組織和正常肝組織（2≥11.95，均P＜0.05）；蛋白定量分析結果提示肝細胞性肝癌中PED/PEA-15（s-116）、P-p27T187蛋白的表達明顯高于癌旁組織和正常肝組織（t≥15.64，均P＜0.05）。見表1。

2.2PED/PEA-15（s-116）、P-p27T187表達與HCC臨床病理特征的關系PED/PEA-15（s-116）、P-p27T187的表達與病理分級、臨床分期及有無門靜脈癌栓均有關（均P＜0.05）；而與發病年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤數目及甲胎蛋白（AFP）水平等均無關（均P＞0.05）。表2。

2.3肝細胞性肝癌中PED/PEA-15（s-116）、P-p27T187表達的相關性分析PED/PEA-15（s-116）和P-p27T187蛋白的表達呈正相關（r=0.056，P＜0.05）。

表1　PED/PEA15（s-116）、P-p27T187在HCC、癌旁及正常肝組織的表達

3　討論

表2　PED/PEA15（s-116）、P-p27T187的表達與HCC臨床病理特征關系

細胞凋亡是一種程序性細胞死亡，不僅對細胞生長、分化和維持機體穩態有很重要的作用，而且還可以通過清除變異的細胞和改變基因表達來阻止細胞發生轉化，而細胞凋亡信號傳導通路的調控往往發生在基因轉錄后階段，通過蛋白質修飾來發揮其生物學效應，蛋白質的磷酸化和去磷酸化過程調節著細胞生長、細胞分化、細胞信號轉導及細胞凋亡等幾乎所有的生命活動。如果凋亡被抑制，發生基因突變的細胞就會得以繼續生存，從而導致腫瘤的發生、發展和轉移。因此，細胞凋亡調控的紊亂與細胞的惡性轉變具有十分密切的關系。近年來，隨著細胞凋亡信號傳導通路研究的不斷深入，凋亡相關因子的作用及其特異性調控機制已成為腫瘤發生、發展、轉移及治療研究的靶點［5］，其中轉錄后階段的蛋白質磷酸化修飾扮演著重要的作用［6］。因此，深入探討磷酸化蛋白PED/PEA-15（s-116）、P-p27T187在凋亡信號傳導通路中的作用，對腫瘤的發生、發展及轉移機制的研究具有重要意義。

PED/PEA-15是從II型糖尿病患者的組織中克隆得到，屬于IAPs家族成員［7］，是一種具有廣譜抗凋亡功能的小分子蛋白質（分子量15kD），由131個氨基酸組成，其前80個氨基酸形成規范的“死亡效應區（DED）”；后51個氨基酸形成結構不規則的C末端尾（含有磷酸化位點）。PED/PEA-15主要參與細胞增殖、分化、細胞信號轉導、細胞周期和凋亡的調控以及葡萄糖轉運過程，與腫瘤的發生、發展和轉移密切相關，在多種腫瘤中表達上調［8-10］。研究表明［8-12］，磷酸化PED/PEA-15（s-116）可通過其DED區域與其他含有該區域的蛋白相結合，從而抑制死亡誘導復合體（DISC）形成，使caspase-8、caspase-10等信號傳導分子失活，阻止caspase系統的級聯激活，從而阻斷凋亡過程，抑制腫瘤細胞的凋亡，促進腫瘤的發生、發展和轉移；磷酸化PED/PEA-15也可通過結合細胞外信號調節酶（ERK），通過ERK-MAP信號傳導通路調節細胞增殖，最終抑制caspase的級聯激活，阻斷細胞凋亡過程，發揮其抑制凋亡的生物學效應。

p27蛋白屬于CDKI家族成員，由198個氨基酸組成，是一種高度保守的蛋白質分子，其進入細胞核后，通過其N末端的CDK結合區，結合cyclin和CDK，能夠抑制Cyclin-CDK復合物的激酶活性，阻礙細胞周期由G1期進入S期，使細胞周期停滯，抑制細胞的增殖，對細胞的生長起負向調控作用，從而促進細胞凋亡［13］。研究表明，p27蛋白水平和功能的障礙可嚴重損害細胞周期的“制動”機制，導致正常細胞的惡性轉化，多種腫瘤中均存在p27蛋白的表達下調或功能障礙［14-16］，然而，p27蛋白在基因水平極少發生缺失或突變，在細胞周期中保持穩定，因此，其在蛋白水平的表達修飾及其在亞細胞中的分布改變可能與腫瘤的發生發展相關，本研究發現在P-p27T187定位于HCC細胞的細胞質中，并在HCC細胞中呈高表達（P＜0.05），其可能作用機制為在HCC的發生過程中，p27蛋白發生磷酸化后由胞核轉移到胞質，改變了亞細胞定位，啟動了Skp2分子介導的泛素/蛋白酶體降解途徑，促進p27的多聚泛素化及隨后的蛋白酶體降解，從而引發細胞周期調控紊亂，抑制細胞凋亡，促進細胞異常增殖，加快腫瘤細胞的播散與侵襲，因此p27基因轉錄后階段的磷酸化修飾有著重要的作用，P27-T187可降低p27蛋白的表達水平及干擾細胞周期穩定，通過AKT/ ERK-MAP信號傳導通路，調節細胞增殖，最終抑制caspase的級聯激活，阻斷細胞凋亡過程，發揮其促進腫瘤細胞增殖及轉移的生物學效應。

本研究中免疫組織化學及Western免疫印跡結果顯示，磷酸化蛋白PED/PEA-15（s-116）和P-p27T187在肝細胞性肝癌組織中的表達強度均明顯高于癌旁組織和正常組織，提示PED/PEA-15（s-116）和P-p27T187在HCC的發生、發展中發揮了重要作用，其機制可能在HCC的發生進展過程中，PED/ PEA-15（s-116）、p27T187的過表達參與了細胞凋亡過程，通過相關的細胞信號傳導通路，參與調節細胞的凋亡，發揮其抗凋亡作用，導致基因突變的積聚，促進細胞的異常增殖及惡性轉化。這表明基因轉錄后階段的磷酸化修飾是細胞凋亡信號傳導通路的重要組成部分，其可調控、干擾甚至阻斷信號傳導通路，抑制細胞的正常凋亡及分化，促進其增殖，與腫瘤的發生發展有著密切的關系。本研究還發現PED/ PEA-15（s-116）和P-p27T187蛋白的表達與HCC患者的發病年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤數目、AFP水平大小無關；而與HCC的Edmondson病理分級、臨床分期及轉移相關，腫瘤分化程度越低、臨床晚期及有門靜脈癌栓的HCC組織中表達強度逐漸增強。提示PED/PEA-15（s-116）和P-p27T187對HCC的發生發展及轉移可能具有促進作用，此外，HCC組織中PED/PEA-15（s-116）和P-p27T187蛋白的表達呈正相關，提示兩者在抗凋亡作用中發揮著協同作用。

總之，磷酸化蛋白PED/PEA-15（s-116）和P-p27T187與HCC的發生發展密切相關，二者可能通過細胞信號傳導通路共同參與了細胞的凋亡過程，并協同抑制HCC細胞的凋亡，本研究結果為今后進一步深入研究二者在HCC發生、發展及轉移中的相互作用機制奠定了有利基礎。磷酸化蛋白PED/ PEA-15（s-116）和P-p27T187可能成為肝細胞肝癌臨床治療和藥物研發的新靶點。

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（本文編輯：姜曉慶）

Express and clinical significance of phosphoryprotein PED/PEA-15 and P-p27T187 in hepatocellular carcinoma

WUYifeng，ZHUKelei，CHENLei，WANGJingwen，LIDingyao，CHENMingliang.（Yinzhou HospitalAffiliated to Ningbo university，Ningbo 315040，Zhejiang，China）
Corresponding author:CHEN Mingliang，Email:wyf5495@163.com

ObjectiveTo investigate the expression of phosphoryprotein PED/PEA-15（s-116）and P-p27T187 in hepatocellular carcinoma（HCC），and to reveal the possible action mechanism of carcinogenesis and cancerometastasis in HCC.MethodsThe protein expressions of PED/PEA-15（s-116）and P-p27T187 were detected by immunohistochemistry and Western blot in resected liver tumor tissues and corresponding adjacent noncancerous tissues from 40 HCC patients and normal liver tissues from 12 patients with benign lesions，their relationship with HCCwas analyzed by Spearman rank correlation.ResultsThe protein expressions of PED/PEA-15（s-116）and P-p27T187 were significantly higher than those in adjacent tissues and normal tissues（all P＜0.05），and they were significantly associatedwiththepathologicalgrade，clinicalstageandmetastasizeofHCC（allP＜0.05）.Howevertherewasnosignificant correlation with age，gender，size oftumor，numbers oftumorand alpha fetoprotein（AFP）level（allP＞0.05）.Spearman rank correlation analysis showed that PED/PEA-15（s-116）was correlated with P-p27T187 in HCC tissues（r=0.056，P＜0.05）.ConclusionsPED/PEA-15（s-116）and P-p27T187 are highly expressed in HCC，which are associated with the occurrence，development and metastasis of HCCand may become a newtarget for gene therapy of HCC.

Hepatocellular carcinoma；PED/PEA-15（s-116）；P-p27T187

10.3969/j.issn.1671-0800.2016.09.005

R735.7

A

1671-0800（2016）09-1134-05

寧波市科技計劃（201401C5010016）

315040寧波，寧波大學醫學院附屬鄞州醫院（吳益峰、朱柯磊、陳磊、蔣存兵、李定耀、陳明良）；大連醫科大學（王靜文）

陳明良，Email：wyf5495@163.com

2016-03-11