大孔吸附樹脂分離純化苗藥雪人參中α—葡萄糖苷酶抑制物質(zhì)的研究

王小果 張汝國 王明 司高飛

【摘要】目的：篩選出純化苗藥雪人參中α-葡萄糖苷酶抑制物質(zhì)的最佳大孔樹脂，并對影響分離純化的主要因素進行探討，確定最優(yōu)工藝參數(shù)。方法：采用分光光度法和酶標法測定雪人參乙醇提取液中α-葡萄糖苷酶抑制物質(zhì)的含量，并通過靜態(tài)吸附和動態(tài)吸附兩種方法篩選出最佳大孔樹脂，以α-葡萄糖苷酶抑制物質(zhì)酶活性抑制率為指標對優(yōu)化后的工藝條件進行驗證。結果：大孔樹脂HPD600在室溫下吸附效果最好，優(yōu)化后的工藝參數(shù)為提取液pH=80、提取液體積與大孔樹脂質(zhì)量之比為1∶[KG-*3/5]10，洗脫劑為70%乙醇溶液，洗脫體積為3BV。結論：純化前后α-葡萄糖苷酶抑制物質(zhì)酶活性抑制率提高約3倍，工藝穩(wěn)定。

【關鍵詞】雪人參；大孔吸附樹脂；α-葡萄糖苷酶抑制物質(zhì)

【中圖分類號】R2842【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2016）18-0017-04

近年來，糖尿病發(fā)病率逐年增大，已成為繼腫瘤和心腦血管疾病后的第三大慢性疾病，因此側重長期治療且措施個體化，以達到控制病情、防止或減少并發(fā)癥的目的[1]。而傳統(tǒng)降糖藥物對血糖的控制并不理想[2]。臨床研究表明，α-葡萄糖苷酶抑制劑是一類新型口服降糖藥物[3]，可以緩解高胰島素血癥和防治餐后高血糖癥，還可以減少血糖波動對機體器官的損傷，提高糖耐量，具有非常廣闊的應用前景。近年開發(fā)的伏格列波糖和米格列醇等作為治療Ⅱ型糖尿病的首選藥和Ⅰ型糖尿病的輔助藥物已廣泛應用于臨床。

[JP+1]雪人參（Radix Indigofera）為豆科木藍屬植物茸毛木藍的根，又名鐵刷子、血人參、紅苦刺和山紅花，主要分布于云南、貴州、廣西等地，具有抗氧化[4]、補虛活血、降血糖及調(diào)經(jīng)舒筋等功效，在貴州苗族地區(qū)，藥用歷史悠久。其化學成分研究表明，其富含黃酮類、萜類、酚類等化合物[5-7]。李園園等[8]報道雪人參乙醇提取物具有α-葡萄糖苷酶抑制作用，但尚未見對雪人參乙醇提取物經(jīng)大孔樹脂純化后對α-葡萄糖苷酶的抑制作用研究。本實驗探討了大孔樹脂分離純化雪人參中α-葡萄糖苷酶抑制物質(zhì)的工藝條件，為α-葡萄糖苷酶抑制劑的制備及應用提供新思路。[JP]

1儀器與材料

11儀器Multiskan MK3酶標儀（美國Thermo Electron公司）；SP-75PC型紫外可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司）；FW-177型中草藥粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司）；BSA224S-CW型電子天平（賽多利斯科學儀器（北京）有限公司）；TGL-16G高速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；HH系列數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市科析儀器有限公司）；PH-618型酸度計（上海儀電科學儀器有限公司）；96微孔酶標板，各型號微量進樣器。

12材料雪人參采集于貴州省都勻市周邊，用中草藥粉碎機粉碎，過20～60目標準篩。4-硝基苯基α-D-吡喃葡萄糖苷（4-N-trophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG，美國Sigma公司）；α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase，美國Sigma公司）；阿卡波糖（Acarbose，德國Serva公司）；二甲基亞砜（DMSO，美國Sigma公司），無水乙醇等均為分析純試劑。

2方法

[JP3]21大孔樹脂的預處理將D101、AB-8、HPD600、HPD100、X-5五種大孔樹脂用95%乙醇浸泡24h后，用95%乙醇淋洗至流出液不渾濁為止，然后用蒸餾水洗至無醇，備用。[JP]

22雪人參中α-葡萄糖苷酶抑制物質(zhì)的提取稱取雪人參粉末100g，加入一定量60%乙醇溶液，回流提取3次，每次2h，合并提取液，離心，上清液減壓蒸干，用20%二甲基亞砜溶液溶解后定容到1000mL容量瓶中，備用。

23大孔樹脂的篩選分別稱取5g上述5種大孔樹脂于100mL錐形瓶中，加入80mL雪人參乙醇提取液（質(zhì)量濃度為2252mg/mL，下同），常溫下在振蕩器上提取2h，靜止24h后，離心分離，以α-葡萄糖苷酶抑制物質(zhì)酶活性抑制率（簡稱酶活性抑制率）為指標，測定上清液中α-葡萄糖苷酶抑制物質(zhì)的含量。酶活性抑制率越小，表明上清液中α-葡萄糖苷酶抑制物質(zhì)的含量越低，則該樹脂的吸附性能就越好[9]。

24α-葡萄糖苷酶抑制物質(zhì)活性測定[10]在96微孔酶標板上，加入112μL磷酸鉀緩沖液（pH=68），8μL上述上清液和20μL 01U/mL α-葡萄糖苷酶，混合均勻后，于37℃恒溫箱中孵育30min，再加入20μL 40mmol/L PNPG開啟反應，置于37℃恒溫箱中反應30min，最后加入80μL 02mol/L Na2CO3溶液終止反應，于405nm處測其OD值，根據(jù)下式計算出上清液中酶活性抑制率（用Y表示），A0表示空白對照組OD值（不加樣液），Aj表示樣品組OD值，由于雪人參乙醇提取液本身就有顏色，因此需要測定其背景吸收，并對測定結果進行校正。

Y=「（Ao-Ai）/A0」×100%

25靜態(tài)吸附

251吸附時間準確稱取5g HPD600大孔樹脂置于100mL錐形瓶中，加入80mL雪人參乙醇提取液，常溫下振蕩2h，靜態(tài)吸附不同時間，離心，測定上清液中α-葡萄糖苷酶抑制物質(zhì)的含量，根據(jù)上述公式計算酶活性抑制率。

252吸附溫度和樹脂質(zhì)量分別稱取不同質(zhì)量的HPD600大孔樹脂置于100mL錐形瓶中，加入提取液80mL，在15、20、25、30、35、40、50℃下振蕩2h，靜態(tài)吸附24h，離心，測定上清液中α-葡萄糖苷酶抑制物質(zhì)的含量，根據(jù)上述公式計算酶活性抑制率。

26動態(tài)吸附分別稱取5g上述5種樹脂，裝入30mm×300mm層析柱中，80mL提取液沖洗該柱，流速控制在2-3 BV/h，收集流出液，先用2BV去離子水沖洗層析柱，再用3BV 70%乙醇溶液洗脫，并收集流出液，減壓蒸干后，用20%二甲基亞砜溶解，定容至50mL，測定α-葡萄糖苷酶抑制物質(zhì)的含量，根據(jù)上述公式計算酶活性抑制率。

261提取液的pH值稱取5g HPD600大孔樹脂7份，濕法裝柱，用5%NaOH和1mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)提取液的pH值分別為10、35、50、60、70、80、100，使80mL不同pH值的提取液經(jīng)過層析柱，以下按26步驟操作。

262洗脫液的篩選取5g HPD600大孔樹脂，濕法裝柱，使80mL提取液經(jīng)過層析柱，吸附完全后，先用2BV去離子水沖洗，再分別用3BV 70%甲醇溶液、70%乙醇溶液和70%乙酸乙酯溶液洗脫，以下按26步驟操作。

263洗脫液的體積分數(shù)稱取5g HPD600大孔樹脂8份，濕法裝柱，各使80mL提取液經(jīng)過層析柱，吸附完全后，先用2BV去離子水沖洗，再分別用3BV 20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、95%乙醇溶液洗脫，以下按26步驟操作。

264洗脫液的用量取5g HPD600大孔樹脂，濕法裝柱，使80mL提取液經(jīng)過層析柱，吸附完全后，先用2BV去離子水沖洗，再分別用1、2、3、4、5BV 70%乙醇溶液洗脫，以下按26步驟操作。

3結果

31靜態(tài)和動態(tài)吸附5種大孔樹脂對雪人參提取液中α-葡萄糖苷酶抑制物質(zhì)的吸附情況如表1所示。被5種大孔樹脂吸附后的提取液中α-葡萄糖苷酶抑制物質(zhì)酶活性抑制率均有所下降，表明5種樹脂對α-葡萄糖苷酶抑制物質(zhì)均有吸附。但由于樹脂的孔徑、極性和比表面積等性質(zhì)的不同，吸附能力亦不相同，其中， HPD-600的酶活性抑制率最低，說明該樹脂對α-葡萄糖苷酶抑制物質(zhì)吸附最多，效果最好，因此選為進一步實驗的最佳樹脂。

32吸附速率吸附速率是衡量吸附效果的重要指標。不同的吸附時間，大孔樹脂對雪人參乙醇提取液中α-葡萄糖苷酶抑制物質(zhì)的吸附效果也不相同，通過對大孔樹脂HPD600吸附時間的考察后發(fā)現(xiàn)，前5h吸附速率較大，之后漸緩，表明該樹脂在5h內(nèi)已基本吸附完全。如圖1。

33溫度和樹脂質(zhì)量對吸附效果的影響25℃時，α-葡萄糖苷酶抑制物質(zhì)酶活性抑制率最低，且隨著HPD600樹脂質(zhì)量的增大，酶活性抑制率逐漸降低，在提取液體積（80mL）和樹脂質(zhì)量（5g）之比為16∶[KG-*3/5]1時基本不再變化，表明該樹脂對α-葡萄糖苷酶抑制物質(zhì)的吸附達到飽和。如圖2。

34提取液pH值當雪人參乙醇提取液的pH值為80時，酶活性抑制率最低，表明HPD600樹脂對提取液中α-葡萄糖苷酶抑制物質(zhì)的吸附率最高，因此選擇提取液pH值為80作為進一步實驗的最佳酸度。詳見圖3。

35洗脫條件的考察結果

351洗脫液的確定實驗通過對70%甲醇溶液、70%乙醇溶液和70%乙酸乙酯溶液的洗脫效果進行考察后發(fā)現(xiàn)，70%乙醇溶液作為洗脫液時，α-葡萄糖苷酶抑制物質(zhì)酶活性抑制率最高，如表2所示，表明洗脫效果最好，故選用為進一步實驗的洗脫液。

352洗脫液體積分數(shù)隨著乙醇溶液體積分數(shù)的增大，洗脫液中α-葡萄糖苷酶抑制物質(zhì)酶活性抑制率逐漸增大，當乙醇濃度為70%時，曲線呈平緩趨勢，考慮到經(jīng)濟成本，采用70%乙醇溶液即可達到較好的解吸效果。見圖4。

353洗脫液用量通過對1、2、3、4、5BV（1BV=25mL）洗脫液洗脫效果的考察后發(fā)現(xiàn)，從第3份洗脫液開始，其中的α-葡萄糖苷酶抑制物質(zhì)已非常微量，表明3倍柱體積的70%乙醇溶液已能基本洗脫樹脂所吸附的α-葡萄糖苷酶抑制物質(zhì)，因此確定洗脫液的體積為3BV。

36工藝驗證按照優(yōu)化后的工藝參數(shù)，將100g雪人參粉末經(jīng)回流提取所得的浸膏制成提取液，使80mL該提取液通過裝有5g HPD600大孔吸附樹脂的層析柱（30mm×300mm）中進行純化，通過測定提取液純化前后α-葡萄糖苷酶抑制物質(zhì)酶活性抑制率驗證純化工藝效果，通過計算，純化前雪人參乙醇提取液中α-葡萄糖苷酶抑制物質(zhì)酶活性抑制率為37%，純化后為7123%，提高約3倍。

4結論

通過對5種大孔吸附樹脂吸附性能的考察，篩選出純化苗藥雪人參乙醇提取液中α-葡萄糖苷酶抑制物質(zhì)的大孔樹脂為HPD600，并通過靜態(tài)和動態(tài)吸附對影響分離純化的主要因素進行優(yōu)化，從而確定出HPD600樹脂在室溫下吸附，吸附時用5%NaOH和1mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)提取液的pH值為80，提取液體積與大孔樹脂質(zhì)量之比為16∶[KG-*3/5]1，采用70%乙醇溶液作為洗脫劑，洗脫體積為3倍柱體積。經(jīng)過大孔樹脂純化后的提取液，對α-葡萄糖苷酶抑制物質(zhì)抑制率提高了約3倍，優(yōu)化工藝穩(wěn)定可行，希望為α-葡萄糖苷酶抑制劑的制備和應用提供一定的參考。

參考文獻

[1]孔曉雯. 糖尿病藥物治療的研究進展[J]. 中國醫(yī)藥指南，2014，12（23）：71-72.

[2] 呂娜，南敏倫，趙昱瑋，等. α-葡萄糖苷酶抑制劑的研究進展[J]. 黑龍江醫(yī)藥，2015，28（2）：238-241.

[3] 劉瑞麗，丁美萍，徐雯，等. α-葡萄糖苷酶抑制劑研究進展[J]. 藥物生物技術，2009，16（4）：388-392.

[4] Li YY， Li CQ， Xu QT， et al. Antioxidant， α-glucosidase inhibitory activities in vitro and alloxan-induced diabetic ratsprotective effect of Indigofera stachyodes Lindl. root[J]. J Med Plant Res，2011，5（14）： 3321-3328.

[5] 楊雅欣，廖尚高，王正，等. 血人參水溶性化學成分的UHPLC-DAD-Q-TOF-MS/MS分析[J]. 中國實驗方劑學雜志，2014，20（23）：63-67.

[6] 傅建，梁光義，張建新，等. 茸毛木藍化學成分研究[J]. 現(xiàn)代藥物與臨床，2013，28（3）：265-268.

[7] 裘璐，梁研，唐貴華，等. 茸毛木藍根的化學成分研究[J]. 中成藥，2013，35（2）：320-323.

[8] 李園園. 茸毛木藍和南湖菱降血糖及保肝作用研究[D]. 開封：河南大學，2012.

[9] 譚永霞，王洪慶，陳若云.長穗桑中的α-葡萄糖苷酶抑制劑成分研究[J]. 中國藥學雜志，2010，45（18）：1376-1379.

[10]李英，張?zhí)m，楊萬山. α-葡萄糖苷酶抑制劑的篩選和初步研究[J]. 上海大學學報（自然科學版），2000，6（2）：129.

（編輯：梁志慶）