丹參口服液對口腔種植體骨結合的影響及機制探討*

山東省青州市濰坊護理職業學院(青州262500)

楊洪濤 常維巍 呂 林

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丹參口服液對口腔種植體骨結合的影響及機制探討*

山東省青州市濰坊護理職業學院(青州262500)

楊洪濤 常維巍 呂 林

目的：通過建立家兔種植體模型,檢測轉化生長因子-β1(TGF-β1)的表達量,探討丹參口服液對口腔種植體骨結合的影響及分子機制。方法：將18只家兔隨機分為實驗組和對照組,每組各9只,均在家兔下頜雙側同一位置植入種植體各1枚。植入種植體的同時對實驗組的家兔給于復方丹參口服液服用3周,分別于術后7 d、14 d、及21 d取種植體周圍組織通過RT-PCR、Western blot檢測TGF-β1 mRNA和蛋白表達水平,并觀察兩組家兔種植體的穩定性,于術后21 d時處死家兔做骨切片,采用HE染色通過圖像分析系統進行骨組織形態學面積測量分析新生骨面積。結果：經口服復方丹參液治療后實驗組TGF-β1 mRNA和蛋白表達水平、新骨組織形成量及新生骨面積明顯增加,與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。 結論：復方丹參口服液能促進口腔種植體骨結合作用,其機制與上調TGF-β1 mRNA和蛋白表達相關。

鈦種植體能與骨組織產生骨性結合且具有良好的組織相容性,目前在口腔種植上應用越來越多。由于牙周疾病、創傷等造成的骨缺損，以及牙槽骨吸收而導致的骨量不足從而影響種植體-骨結合率下降及種植體成功率。 在實施種植后種植體與骨結合的牢固如否,會直接影響種植牙的質量及效果,為更好的促進種植體與骨結合能力和提高成功率,本實驗探討通過丹參口服液上調組織中TGF-β1的表達,對家兔口腔種植體骨結合的促進作用,為臨床口腔種植體修復治療提供新的思路和方法。

材料與方法

1 材 料 實驗動物：健康成年家兔18只,體重1500～1550 g(購自山東大學醫學院動物中心)，雌雄各半單籠飼養,分為實驗組和對照組每組9只；HE染色液(南京建成)；Trizol試劑盒(Invitrogen)；反轉錄試劑盒(Promegea)；PCR試劑盒(Promegea)；羊抗兔TGF-β1單克隆抗體(Santa Cruz)；辣根酶標記二抗(博士德)；ECL發光試劑盒(Santa Cruz)；超凈工作臺(海爾)；低溫高速離心機(Sigma)；臺式離心機(Sigma)；恒溫搖床(Thermo)；PCR儀(ABI 7200型)；DNA電泳儀(BioRad)；蛋白電泳儀(BioRad)；自動凝膠成像分析儀(天能)；-86 ℃冰箱(Fuma)；鈦種植體(北京萊頓生物材料公司)；顯微鏡(Nikon)。

2 種植體植入 在家兔下頜雙側同一位置植入鈦種植體各1枚,植入種植體的同時對實驗組的家兔給于復方丹參口服,服用3周。

3 新生骨面積計算 骨基質呈嗜酸性染色,成骨細胞、骨細胞核呈嗜堿性染色。每組隨機選取2張切片,每張切片于光鏡下(100倍)采圖3張,使用Adobe photoshop CS5將所采集的各組HE染色圖片中非骨組織部分刪去，只留余骨組織部分對成骨面積檢測。使用Motic Med 6.0數碼醫學圖像分析系統對上面所得圖像進行骨組織形態學面積測量,分析新生骨面積(Sbone)占成骨區總面積(Stotal)的相對百分比,計算公式:S= Sbone/Stotal。

4 定量PCR檢測mRNA表達 引物由上海生工生物工程公司設計合成。TGF-β1上游引物：5，-GCAGTGGTTGAGCCGTGG-3，；下游引物：5，-GCTGAAGCAATAGTTGGTGTCC-3，；GAPDH上游引物：5，-AACGGATTTGGTCGTATTGGG-3，；下游引物：5，-TCGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3，。采用trizol法提取組織總RNA，取2 μg反轉錄成cDNA,定量PCR檢測TGF-β1mRNA表達,以GAPDH為內參照。反應體系為:SYBR Green mix12.5μl,ddH2O 8.0 μl,上下游引物各1 μl,cDNA,2.5 μl,總體積25 μl。以2-△△Ct值表示各基因相對表達量。

5 Western blot檢測蛋白表達 取適當大小組織塊加細胞裂解液裂解,經蛋白定量變性后取樣品上樣電泳,轉膜、封閉、加一抗、二抗,加ECL發光試劑液X光片曝光顯色,進行灰度分析。

結 果

1 新骨生成情況 7 d時對照組骨髓腔中發現有大量的顆粒,顆粒之間可見新生的纖維性基質和類骨質，周圍有許多成骨細胞以及部分骨髓組織,骨組織含量相對較少。實驗組骨髓腔中發現復合顆粒溶解吸收,骨基質開始形成骨小梁,其周圍有大量的成骨細胞。而且與對照組相比,實驗組形成的新骨較多,新生骨組織中成骨細胞較少,骨組織相對成熟。14 d時對照組形成的骨小梁開始連成網狀結構，新骨內可見大量骨細胞，新骨形成量增加。實驗組新骨組織形成量明顯增加,骨小梁數目增加,變粗,粗大的骨小梁連接成較密集的網狀結構,均勻充填骨髓腔。21 d時對照組骨小梁粗大較密集,有大量骨細胞。實驗組骨組織相對成熟,可見明顯的鈣化,纖維基質基本吸收,骨細胞數多。

2 新生骨面積 見附表。新生骨面積隨觀察時間延長而增加,實驗組與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。

附表 兩組新生骨面積的比較

注：與對照組比較，*P<0.05

3 TGF-β1 mRNA及蛋白表達 見圖1、2。mRNA相對表達量：對照組7 d、14 d、21 d分別為0.553±0.012；1.043±0.018；1.77±0.021；實驗組7 d、14 d、21 d分別為0.957±0.024；2.653±0.032；3.857±0.063。蛋白表達：對照組7 d、14 d、21 d分別為1.167±0.015；2.107±0.014；2.54±0.011；實驗組7 d、14 d、21 d分別為2.44±0.018；4.253±0.021；5.39±0.024。兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)。

圖1 兩組TGF-β1 mRNA表達

圖2 兩組TGF-β1蛋白表達

討 論

丹參為臨床常用藥,具有抗心肌缺血,擴冠狀動脈,抗心律失常和活血化瘀等藥理作用[1]。有研究報道[2]復方丹參可以促進家兔骨折中期骨愈合,在骨折愈合的中期復方丹參可以促進TGF-β1的表達,其可能是通過增加TGF-β1的表達而促進家兔骨折中期骨愈合。然而,復方丹參是否能促進口腔種植體骨結合未見有報道，種植體-骨界面骨整合的獲得是種植體成功的關鍵。研究表明,轉化生長因子β(TGF-β)超家族成員在發育和組織內具有多功能生長因子作用,能調節細胞生長、死亡或凋亡、細胞分化及細胞外基質合成等生物學功能[3-4]。TGF-β1是重要的促纖維生長因子,能直接促進成纖維細胞的增殖,并促使肌細胞、上皮細胞等合成分泌細胞外基質,促進膠原、骨結合蛋白、糖蛋白等合成，參與體內生理生化、信號轉到與調控,及促進成骨細胞的分化增殖[5]。關于TGF-β1與很多相關疾病的報道較多并引起關注,有關中藥對TGF-β1調控研究報道較少。因此，本研究采用中藥復方丹參口服液治療及觀察家兔種植體的穩定性,探討其對口腔種植體骨結合的促進作用。實驗結果顯示7 d時對照組骨髓腔中發現有大量的顆粒，顆粒之間可見新生的纖維性基質和類骨質，周圍有許多成骨細胞以及部分骨髓組織，骨組織含量相對較少。實驗組骨髓腔中發現復合顆粒溶解吸收，骨基質開始形成骨小梁，其周圍有大量的成骨細胞。而且與對照組相比，實驗組形成的新骨較多，新生骨組織中成骨細胞較少，骨組織相對成熟。14 d時對照組形成的骨小梁開始連成網狀結構，新骨內可見大量骨細胞，新骨形成量增加。實驗組新骨組織形成量明顯增加，骨小梁數目增加，變粗，粗大的骨小梁連接成較密集的網狀結構，均勻充填骨髓腔。21 d時對照組骨小梁粗大較密集，有大量骨細胞。實驗組骨組織相對成熟,可見明顯的鈣化，纖維基質基本吸收,骨細胞數多。新生骨面積隨術后觀察時間延長而增加,實驗組與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。TGF-β1 mRNA和蛋白表達相同也隨術后時間延長而增加,實驗組與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。表明復方丹參口服液能上調TGF-β1 mRNA的表達有利于新骨生成,TGF-β1對上皮細胞具有趨化增殖作用,促進膠原基質黏附及創傷愈合[6-7]。提示中藥復方丹參口服液可以上調轉化生長因子-β1的表達從而間接促進種植體骨結合。與文獻報道[2]基本相同,但不同的是本研究結果顯示復方丹參口服液對術后各期的TGF-β1 mRNA和蛋白的表達都有上調和促進作用。參與促進種植體骨結合作用的可能有多種因子有待于進一步深入研究和探討。將中醫常用藥物丹參口服液運用到現代口腔種植骨結合的治療,有利于促進口腔種植體的治療及技術的完善和提高種植體的穩定性,拓展傳統中醫藥與現代醫學技術的結合,讓傳統中醫藥應用有廣闊的前景。

[1] 李愛萍.丹參臨床配伍應用分析[J].陜西中醫,2011,32(9):1243-1244.

[2] 張 曉,張國慶,顧伯林,等.丹參及其有效成分對骨代謝影響的實驗研究進展[J].中國骨質疏松雜志,2015,01:112-116.

[3] Gan L,Zhong JF,Zhang RH,etal.The immediate intramedul-lary nailing surgery increased the mitochondrial

DNArelease thataggravated systemic inflammatory response and lung injury inducedby elderly hip fractu[J].Mediators Inflamm,2015,15：387-578．

[4] Megalu AJ,Glava C,Vilaeti AD,etal.Transforming growth factor-β inhibition and endothelin receptor blockade in rats with monocrotaline-induced pulmonary hypertension[J].Pulm Circ,2012 ,2(4):461-469.

[5] 王 敏,程 政,姚天華,等.人骨形態發生蛋白2基因治療大鼠牙槽骨缺損的實驗研究[J].陜西醫學雜志,2010,39(2):131-133,139.

[6] 張 冉,任光輝,李 蕾,等.轉化生長因子-β1對氧化鋯表面小鼠胚胎成骨細胞前體細胞黏附、增殖及分化的影響研究[J].中國實用口腔科雜志,2015,05:309-312.

[7] 宋昭君,倪衛東,高仕長.丹參注射液對骨折愈合過程中BMP-7、TGF-β1及bFGF表達的影響[J].第三軍醫大學學報,2013,34(3)：223-227.

(收稿：2016-04-01)

*山東省濰坊市科技計劃項目(201302131)

牙種植體,單牙 骨結合 丹參口服液 轉化生長因子β1

R783.3

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2016.10.002