miR-99b在新輔助化療宮頸癌組織中的表達*

陜西省人民醫院(西安710068)

李連香 于翠革 陳麗宏 楊曉梅

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miR-99b在新輔助化療宮頸癌組織中的表達*

陜西省人民醫院(西安710068)

李連香 于翠革 陳麗宏 楊曉梅

目的：研究miRNA-99b(miR-99b)在新輔助化療宮頸癌組織中的表達。方法：宮頸癌患者55例分別于新輔助化療前后收集腫瘤組織標本行micRNA的提取、反轉錄、實時定量PCR檢測miR-99b的表達。結果：宮頸癌新輔助化療后miRNA99b表達顯著上升,與治療前表達比較有統計學差異(P<0.05)。結論：新輔助化療可通過上調miRNA-99b表達,實現對宮頸癌的抑制。

宮頸癌傳統的治療方法是手術和放療,近年來宮頸癌的化療逐漸成為關注和研究的熱點。吳維光等[1]為探討miRNA-99b(miR-99b)調控宮頸癌細胞增殖和誘導凋亡的可能機制,應用Western blot 檢測了miR-99b 靶基因CDC-25A 蛋白表達,發現miR-99b 上調表達后,細胞CDC-25A 表達降低。表明miR-99b 可通過調控靶基因CDC-25A 表達,調控宮頸癌細胞的增殖和凋亡。據此分析,miR-99b 在宮頸癌的發生和發展過程中可能起重要作用,上調miR-99b 表達可抑制宮頸癌細胞增殖,誘導細胞凋亡。miR-99b 有可能成為宮頸癌治療的靶基因。本研究在前期觀察了新輔助化療對巨快性宮頸癌的臨床治療效果的基礎上,進一步研究miR-99b在新輔助化療宮頸癌前后組織中的表達。

資料與方法

1 一般資料 收集2014年1月至2015年6月我科就診的宮頸癌患者55例,年齡35～68歲,平均54歲。Ib2期25例,IIa期 18例,IIb～IVa期 12例。鱗癌39例,腺癌14例,鱗腺癌2例。高分化29例,中分化15例,低分化11例。55例患者分別于新輔助化療前后收集腫瘤組織標本。

2 實驗方法 ①組織中micRNA的提取：使用RNAiso for Small RNA(TAKARA D340A)試劑盒進行組織中RNA的提取。②反轉錄：使用One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis (TAKARA D350A)一步法miRNA反轉錄試劑盒進行miRNA反轉錄反應,取1000 ng RNA進行反轉錄。③實時定量PCR：使用SYBR Premix Ex TaqTMII (TAKARA DRR081)實時定量試劑盒進行實時定量檢測。將反轉錄得到的20μl cDNA添加RNase Free dH2O補足至100μl。取2μl稀釋液加入到Real Time PCR反應體系中,進行定量檢測。③數據分析：使用ABI 7300分析軟件,用雙標準曲線法分析宮頸癌組織新輔助化療前后miRNA表達水平變化,從has-miR-99b中挑選出表達水平變化趨勢與芯片分析結果一致的miRNA,以Human_RNU1A作為內參。

結 果

1 組織中miRNA的提取 使用RNAiso for Small RNA小RNA提取試劑盒,從組織中提取small RNA，RNA比值在1.8～2.0,說明組織中的RNA質量完好,電泳圖顯示小RNA結果,如圖1。

M：50bp DNA Ladder Marker；1, 2：small RNA

2 RT-PCR 電泳結果 以small RNA反轉錄的cDNA為模板,以miRNA上下游引物擴增目的片段,取8 μl qPCR產物進行3 % 瓊脂糖凝膠電泳,結果顯示擴增出來的miRNA即為目的片段,片段大小為90bp，結果如圖2。

7,8：has- miR-99b Mix 擴增產物/平行樣；1,2：陰性對照 dH2O

3 實時定量PCR驗證結果 使用相對定量法檢測新輔助化療前后miRNA-99b，用標準曲線法校正批次之間的差異。通過定量擴增計算出miRNA-99b的標準曲線為：內參Human_RNU1A為：y=-3.62x+22.44；has-miR-99b為：y =-3.1x+31.13；其擴增效率為:1.04在0.8與1.2之間(見圖3～5)。新輔助化療治療前后miR99b表達水平改變倍數發生了明顯的變化,新輔助化療后miRNA99b表達較治療前表達明顯增高(P<0.05)。

討 論

目前,已發現多種microRNA(miRNA)與腫瘤發生相關,但與宮頸癌新輔助化療治療機制相關的miRNA仍在探索之中。有研究發現,miRNA-99b(miR-99b) 在人乳頭瘤狀病毒(HPV) 陽性的宮頸腺癌組織中低表達[2-3]。但這并不表明表達量有變化的miRNA分子都參與了腫瘤的形成。很多miRNA可能只是間接地受到癌變過程中基因組或生理變化的影響，而不是根本起因。目前癌癥研究的主要目標之一是發掘真正與癌癥形成相關的miRNA[4]。

現有的研究表明,在宮頸癌中,miRNAs表達分上調和下調兩種。其中上調表達的miRNAs有miRNA-210，182,183,200c,203,193b,34a,31,210,27a,503,27b,199a,199b,145,133a,133b,214和127等。而下調表達的miRNAs包括：miRNA-126,145,451,195,143,199b,1,495,497,133b,223,146a,126-AS,150,376a,214,487b,10b,218,149和203等[5-6]。本研究通過前期試驗發現新輔助化療能明顯降低巨塊型宮頸癌的直徑,增加手術機會,提高手術幾率,為根治手術創造條件。通過實時定量PCR發現與宮頸癌新輔助化療確切相關的miRNA為miRNA-99b。治療后兩者皆顯著上升(P<0.05)。

miRNA-99b與宮頸癌的關系目前國外尚未見報道,國內報道較少。吳維光等[1]通過基因芯片發現miRNA-99b與HPV感染的宮頸癌相關。HPV感染的宮頸癌細胞miRNA-99b呈低表達。我們的研究也發現,經過新輔助化療,宮頸癌組織中miRNA-99b呈上調趨勢,較治療前增加近6倍,且前期臨床觀察發現宮頸癌新輔助化療后癌灶明顯減小,證明了新輔助化療可能通過上調miRNA-99b表達,促進宮頸癌細胞凋亡,從而達到抑制腫瘤的治療效果。從此研究結果也證明了新輔助化療將miRNA-99b作為宮頸癌治療靶點的可能性。

綜上所述,新輔助化療可通過上調miRNA-99b表達,實現對宮頸癌的抑制。然而miRNA-99b的靶蛋白及其涉及的相關通路尚待進一步研究。

[1] 吳維光,孫小麗,陳 勃,等.microRNA-99b 表達調控對宮頸癌HeLa細胞增殖和凋亡的作用[J].現代婦產科進展,2008,17(10)：752-755.

[2] Zhou WY,Chen JC,Jiao TT,etal.MicroRNA-181 targets YinYang 1 expression and inhibits cervical cancer progression[J].Mol Med Rep,2015,11( 6) : 4541-4546．

[3] Wang L,Chang L,Li Z,etal.miR-99a and -99b inhibit cervicalcancer cell proliferation and invasion by targeting mTOR signalingpathway[J].Med Oncol,2014,31(5)：934．

[4] Yanihara N,Caplen N,Bowman E,etal. Unique microRNA molecμLar profiles in lung cancer diagnosis and prognosis[J]. Cancer Cell,2011,9(3)：189-198.

[5] Reshmi G,Radhakrishna PM.Beyond HPV:Oncomirs as new players in cervical cancer[J]. FEBS Letters,2008,582(30)：4113-4116.

[6] 任 俊. MicroRNA在腫瘤中的研究進展[J].醫學綜述,2012,18(8)：1170-1173.

(收稿：2016-02-23)

Expression of the miR-99b before and after neo adjuvant chemotherapy of cervical cancer

Shaanxi Provincial People’s Hospital(Xi’an 710068)

Li Lianxiang Yu Cuige Chen Lihong et al

Objective：To study the expression of the miR-99b before and after neo adjuvant chemotherapy of cervical cancer.Methods: Through micRNA extraction,reverse transcription, timing quantitative PCR detection the expression of miR-99b in the tumor tissue respectively before and after neoadjuvant chemotherapy in the patients with cervical cancer.Results: After neoadjuvant chemotherapy the cervical cancer miR-99b expression was significantly higher(P<0.05).Conclusion: Neoadjuvant chemotherapy can inhibition of cervical cancer through raising the expression of the miR-99b.

Uterine cervical neoplasms Gene expression regulation,neoplastic @miRNA-99b

*陜西省社發攻關資助項目(2010K01-156)

子宮頸腫瘤 基因表達調控,腫瘤 @miRNA-99b

R737.33

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2016.10.007