白藜蘆醇抑制胰腺癌裸鼠移植瘤生長的實驗研究*

西安市中心醫院普外二科(西安 710004)

秦 勇 馬清涌△ 黨曉燕◇ 孫師元◇▲

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·論著·基礎研究·

白藜蘆醇抑制胰腺癌裸鼠移植瘤生長的實驗研究*

西安市中心醫院普外二科(西安 710004)

秦 勇馬清涌△黨曉燕◇孫師元◇▲

目的:觀察白藜蘆醇(Res)對人胰腺癌Miapaca-2(PC-2)細胞構建的胰腺癌裸鼠皮下移植瘤生長的抑制作用,并探討其作用機制。方法:建立胰腺癌裸鼠移植瘤模型并隨機分組,分別給予3種不同濃度的白藜蘆醇干預后處死胰腺癌裸鼠,取出移植瘤,觀察其體積、重量的變化情況；HE染色法觀察移植瘤組織病理學變化；采用實時定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)和Western bolt法測定移植瘤組織Bcl-2、Bax、p53蛋白和mRNA表達水平。結果：Res組移植瘤的體積、重量明顯低于陰性對照組,隨著濃度增加變化越明顯(P<0.01)；3個濃度組白藜蘆醇作用于胰腺癌裸鼠后,移植瘤組織中Bcl-2、Bax、p53蛋白和mRNA表達水平較陰性對照組差異具有統計學意義(P<0.01),且隨著濃度增加表達水平的差異越明顯。結論: 白藜蘆醇可能通過調節Bcl-2、Bax、p53的表達來抑制胰腺癌移植瘤的生長。

白藜蘆醇(Resveratrol,Res)是存在于虎杖、松樹、葡萄等天然植物當中的多酚類化合物,對植物本身起保護作用[1]。研究發現Res具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等多種生物學活性,近年來其抗腫瘤活性越來越引起人們的關注。有研究顯示[2-3],Res在體外能抑制胰腺癌、胃癌、乳腺癌等多種腫瘤細胞的生長。但目前的研究多集中在Res對腫瘤細胞的體外研究,而有關Res對裸鼠移植瘤的體內研究甚少。本研究即通過建立胰腺癌裸鼠移植瘤模型，觀察Res對胰腺癌裸鼠移植瘤生長的抑制作用,并通過RT-PCR和Western bolt法觀察Res對移植瘤組織中Bcl-2、Bax、p53蛋白和mRNA表達水平的影響,以探索Res抑制胰腺癌裸鼠移植瘤生長的可能作用機制。

材料和方法

1 材 料 人胰腺癌細胞株Miapaca-2購自北京協和醫學院。BALB/C裸鼠,購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,30只實驗用裸鼠,均為雌性,6周齡,體重在l4～l6 g之間。白藜蘆醇購自美國Sigma公司,純度<99.9%,用二甲基亞砜(DMSO)溶解后蒸餾水配成濃度為400 μmol/L,消毒后,-20℃凍存備用。5-FU注射液購自上海旭東海普藥業公司。Bcl-2、Bax、p53一抗和二抗購自美國Sant Cruz公司。引物序列由Takara公司合成。PCR MasterMix購自Takara公司。其它常用試劑均為國產分析純。

2 細胞培養及分組 人胰腺癌Miapaca-2細胞在37℃,5% CO2培養箱中,用DMEM培養液(含10%小牛血清、1% L-谷氨酰胺、100 mg/L鏈霉素、100 IU/ml青霉素)傳代培養,待70%～80%融合時,用2.5 g/L胰酶進行消化傳代后繼續培養。取對數生長期的細胞準備造模。實驗分5組：Res高濃度組(200 μg/ml)、中濃度組(100 μg/ml)、低濃度組(50 μg/ml)、5-FU組(750 μg/ml)、陰性對照組(生理鹽水)。5-FU組為陽性對照組。濃度選擇參照文獻[4]。

3 胰腺癌裸鼠移植瘤模型制備 將BALB/C裸鼠飼養于無菌層流室內,每籠10只,每3 d換1次飼料、飲水及墊料,保持恒溫25±2℃、恒濕45%～50%。取對數生長期的細胞,分別制成細胞濃度為1×108/ml的懸浮液,再用6號針頭的注射器抽取200 μl細胞懸液，接種于裸鼠雙側大腿上方的背部皮下(每組10只)。以皮下結節直徑達0.5 cm為成瘤標準,成瘤時間約為1周左右,1周后檢查發現裸鼠體內腫瘤長徑約0.8 cm,故判斷胰腺癌裸鼠移植瘤模型造模成功,30只大鼠中有3只死亡,2只造模失敗,所以造模后,隨機將25只裸鼠分別入組,每組5只。

4 裸鼠抑瘤實驗 5組裸鼠分別用5 ml注射器內穿刺針抽取0.2 ml等體積溶液(以培養液定容),對瘤體多點(1～4點)注射,1次/d,共14 d。給藥期間每2 d測量裸鼠體重及移植瘤長徑、短徑。末次給藥48 h后用脊髓脫臼法處死裸鼠,仔細、完整剝離移植瘤后,用PBS液快速沖洗,表面液體用濾紙吸干,然后用電子天平稱進行稱重,每個移植瘤的稱重重復3次。用游標卡尺測量移植瘤的最長徑L和短徑W,每次重復3遍。腫瘤體積計算公式如下：V=L×W2/2,求其平均值。腫瘤重量抑制率(%)=(1-實驗組腫瘤重量/對照組腫瘤重量)×100%，腫瘤體積抑制率(%)=(1-實驗組腫瘤體積/對照組腫瘤體積)×100%。

5 移植瘤組織病理學檢查 將移植瘤組織進行稱重，再用4%多聚甲醛進行固定、脫水，最后石蠟包埋，常規4 μm切片，60℃烘箱烘干、冷卻后HE染色,用中性樹膠封片,光鏡下觀察各組移植瘤組織病理學變化。

6 移植瘤組織Bcl-2、Bax及p53蛋白檢測 分別提取各組裸鼠移植瘤組織總蛋白,將其進行電泳后,轉移至硝酸纖維膜上進行封閉,再分別與抗β-actin、Bcl-2、Bax及p53單克隆抗體進行雜交和二抗反應,最后行化學發光法檢測陽性條帶。

7 移植瘤組織Bcl-2、Bax及p53 mRNA檢測 按上述分組,將裸鼠移植瘤組織總RNA用Trizol Reagent試劑盒進行提取，隨后用Fermentas逆轉錄試劑盒將RNA轉錄為cDNA。PCR總反應體系為25 μl,內含2×Taq PCR Master Mix 12.5 μl,cDNA產物2 μl,正義引物1 μl ,反義引物1 μl 以及ddH2O(滅菌去離子水)8.5 μl。PCR 反應條件：預變性，94℃、5 min；變性,94℃、30 s；退火,60℃、30 s；延伸,72℃、30 s；共進行35個循環。最后于72℃延伸7 min后結束。引物序列β-actin：上游引物 5'-ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3',下游引物 5'-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3'，擴增基因片段長度為179bp；Ihh：上游引物 5'-CATTGAGACTTGACTGGGCAAC-3'，下游引物 3'-AGAGCAGGCTGAGTTGGGAGTCGC-5',擴增基因片段長度為405bp；Smo：上游引物 5'-CCTTTGGCTTTGTGCTCATTACCTT-3',下游引物 3'-CGT-CACTCTGCCCAGTCAACCT-5'，擴增基因片段長度為407bp；Ptch: 上游引物 5 -ATGCTGGCGG-GATCTGAGTTCGACT-3,下游引物 3' -GGGTGTGGGCAGGCGGTTCAAG-5',擴增基因片段長度為789bp。陰性對照總RNA的反應體系用滅菌去離子水代替進行逆轉錄及PCR擴增。然后各取9 μl PCR產物,加入 1 μl 10×Loading Buffer,經2.5%瓊脂糖凝膠電泳40 min,在紫外透射分析儀下觀察并拍照。通過GIS22009全自動數碼凝膠圖像分析系統進行各條帶光密度的分析,β-actin作為內參基因評估各組Bcl-2、Bax及p53 mRNA的相對表達量。目的基因相對表達量按照2-ΔΔCt法計算。

結 果

1 不同組別裸鼠皮下移植瘤重量及體積變化 見附表。經過14 d處理后,Res高濃度組、中濃度組、低濃度組的移植瘤重量及體積明顯小于陰性對照組(P<0.01)；Res高濃度組與中、低濃度組比較，移植瘤重量及體積之間也有明顯差異，且隨著濃度增加腫瘤重量及體積減小越明顯(P<0.01)，但Res中、低濃度組之間差異不明顯；與5-FU組比較，除Res高濃度組外，與其余各組均有統計學差異(P<0.01)；同時腫瘤重量及體積抑制率也呈現同樣的變化。

附表 裸鼠皮下腫瘤體積及重量變化

注：與陰性對照組比較,*P<0.01；與5-FU組比較,#P<0.01；與Res高濃度組比較,▲P<0.01

2 移植瘤病理學特征 見圖1。經石蠟切片后行HE染色,病理確診為胰腺腺癌。光鏡下的形態特點: 可見腫瘤細胞呈圓形、多角形,分布均勻,排列致密,細胞核呈圓形、橢圓形,染色質深染,分裂像多見,呈異質性,胞漿較少,略嗜伊紅,細胞間質少見。陰性對照組基本全是胰腺癌組織，Res組還可見部分正常胰腺組織。

3 Western blot檢測各組裸鼠移植瘤組織中Bcl-2、Bax及p53的蛋白表達水平 見圖2。

圖1 移植瘤病理切片(HE×400)

與陰性對照組比較,3組Res注射組中Bcl-2蛋白的表達明顯下降(P<0.01)；與5-FU組比較,Res高、中濃度組Bcl-2蛋白顯著下降(P<0.01)。與陰性對照組比較,3組Res注射組的Bax和 p53蛋白表達水平明顯增高(P<0.01)，效應呈濃度效應關系；與5-FU組比較,Res高、中濃度組的Bax蛋白表達水平明顯增高(P<0.01)，而Res 3個注射組的p53蛋白表達水平與5-FU組比較無明顯差異。

(A: Res高濃度組；B: Res中濃度組；C: Res低濃度組；D: 5-FU組；E: 陰性對照組)(與陰性對照組比較，*P<0.01；與5-FU組比較，#P<0.01)

4 RT-PCR方法檢測各組裸鼠移植瘤組織中Bcl-2、Bax及p53 mRNA的表達水平 見圖3。結果顯示：與陰性對照組比較,各濃度Res注射組中Bcl-2 mRNA的水平明顯下降(P<0.01)，效應呈濃度效應關系；與5-FU組比較,Res高、中濃度組中Bcl-2的mRNA表達顯著下降(P<0.01)。而與陰性對照組比較,各濃度Res注射組中Bax和 p53的mRNA水平均明顯增加(P<0.01)，且效應呈濃度效應關系；與5-FU組比較,高濃度Res組中Bax的mRNA水平明顯增高(P<0.01),而p53的mRNA水平在Res高、中濃度組中顯著增高(P<0.01)。

(A: Res高濃度組； B: Res中濃度組；C: Res低濃度組；D: 5-FU組；E: 陰性對照組)(與陰性對照組比較，*P<0.01；與5-FU組比較，#P<0.01)

討 論

建立胰腺癌裸鼠模型,在胰腺癌研究中是不可或缺的。它可以更好地模擬胰腺癌細胞在人體內的生物學行為[5-6]。本實驗采用BALB/C裸鼠,其無T細胞免疫力,對異種移植無排斥反應,具有移植成功率高的特點,目前已廣泛應用于各種腫瘤的基礎研究[7]。

經過14 d處理后,對Res各濃度組移植瘤組織的重量、體積及其抑制率變化情況的觀察發現,與陰性對照組相比,Res各濃度組對移植瘤生長均有不同程度的抑制作用,Res高濃度組、中濃度組、低濃度組的移植瘤重量及體積明顯小于陰性對照組(P<0.01)；隨著Res濃度的增加,移植瘤組織的重量、體積的減小越明顯,但中、低濃度組之間的差異不顯著；同時,Res高濃度組與5-FU組相比,兩者對移植瘤重量、體積的影響并沒有明顯差異(P>0.05),其抑制率的變化也呈現同樣的特點。移植瘤的病理切片也證實了Res的抑瘤效果。故表明Res對胰腺癌裸鼠Miapaca-2細胞株移植瘤的生長具有一定的抑制作用,特別是Res的濃度達到一定程度時,其對胰腺癌裸鼠移植瘤的抑制作用與5-FU的效果基本相同，進一步說明Res對胰腺癌裸鼠移植瘤的抑制效果與其濃度有關。

腫瘤的發生、發展與腫瘤細胞凋亡與增殖之間的失衡有關,腫瘤細胞的凋亡由凋亡相關基因決定。細胞凋亡基因可分為凋亡促進基因和凋亡抑制基因兩大類,其中Bcl-2是一種凋亡抑制基因,Bax是一種凋亡促進基因。腫瘤是否發生凋亡與Bcl-2 和Bax兩者的比例有關,Bcl-2占主導時抑制腫瘤細胞發生凋亡,Bax占主導時促進腫瘤細胞發生凋亡。p53是一種抑癌基因,其通過直接激活Bax基因的表達及下調Bcl-2基因的表達來誘導細胞發生凋亡[8]。有研究顯示[9]：Res可通過促進腫瘤細胞發生凋亡,達到抑制腫瘤生長的作用。故我們又進一步測定了胰腺癌裸鼠移植瘤組織中Bcl-2、Bax、p53的表達情況,結果也發現,與陰性對照組比較，Res各濃度組能顯著減少移植瘤組織中Bcl-2蛋白及mRNA的表達(P<0.01),且效應呈濃度依賴關系；同時發現其也能顯著增加移植瘤組織中Bax、p53蛋白及mRNA的表達(P<0.01)，其效應同樣呈濃度依賴關系。與5-FU組比較,除p53蛋白表達水平與5-FU組比較無明顯差異外,Res高濃度組中Bcl-2的蛋白和mRNA表達顯著下降(P<0.01)；Bax、p53的蛋白和mRNA水平明顯增高(P<0.01)，表明Res可降低胰腺癌裸鼠移植瘤組織中Bcl-2的表達,增強Bax、p53的表達,且Res對Bcl-2,Bax、p53的影響效果與其濃度有關,呈濃度效應關系,其中高濃度Res的影響效果比5-FU更顯著。

綜上所述,Res可能通過下調Bcl-2的表達、同時上調Bax和p53的表達誘導人胰腺癌Miapaca-2細胞株發生凋亡,最終抑制胰腺癌裸鼠移植瘤的生長。這種抑制效果與Res的濃度有關,高濃度Res的抑制作用與5-FU的效果基本相同。但其確切的作用機制需要進一步研究。

[1] 王廣生,王 菲,強 輝,等. 白藜蘆醇抗氧化應激效應對大鼠脊髓損傷組織的保護[J].陜西中醫,2011,32 (1)： 111-113.

[2] Atten MJ,Godoy-Romero E,Attar BM,etal.Resveratrol regulates cellular PKC alpha and delta to inhibit growth and induce apoptosis in gastric cancer cells[J].Invest New Drugs,2010,23(2)：111-119.

[3] Pozo-Guisado E,Merino JM,Mulero-Navarro S,etal.Resveratrol induced apoptosis in MCF-7 human breast cancer cells involves a caspase-independent mechanism with downregulation of Bcl-2 and NF-κappa B[J].Int J Cancer,2011,115(1):74-84.

[4] Jones SB,DePrimo SE,Whitfield ML,etal.Resveratrol2induced gene expression profiles in human prostate cancer cells [J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2013,14(3)：596-604.

[5] Vazquez Blanco M,Roisinblit J,Grosso O,etal.Left ventricular function impairment in pregnancy induced hypertension[J].Am J Hypertens,2011,14(3)：271-275.

[6] Haque A,Qtsuji Y,Yoshifuku S,etal.Effects of value dysfunction on Doppler Tel index[J].J Am Soc Echocardiogr,2012,15(9):877-883.

[7] 張 波,趙玉沛,鄧一伶,等.人胰腺癌荷瘤小鼠模型的建立及其生物學特性的研究[J].華西醫學,2011,16(4)：399-400.

[8] Chang SF,Sun YY,Yang LY,etal.Bcl-2 gene family expression in the brain of rat offspring after gestational and lactational dioxinexposure[J].Ann NY Acad Sci,2015,10(42):471-480.

[9] Jiao HQ,Wang R,Sun HM,etal.Resveratrol on the growth of human skin cancer cell line A431 and its underlying mechanism[J].J Capital Medical University,2013,30(2)：212-217.

(收稿：2016-03-31)

The tumor inhibition study of resveratrol on pancreatic cancer cell xenograft in nude mice

Department of the Second General Surgery，Xi’an Central Hospital(Xi’an 710004)

Qin Yong Ma Qingyong Dang Xiaoyan et al

Objective：To investigate the antitumor effect of Resveratrol on pancreatic cancer Miapaca-2 cell xenograft on athymic. Methods：The pancreatic cancer Miapaca-2 cell xenograft model in nude mice was established and randomly divided into the blank group, the Res group and the saline negative control group. After intervention with Res, the mice was killed. The weight and volume of tumor were recorded. The pathological change of tumor tissue in each group was observed under microscope with HE staining.Real-time quantitative RT-polymerase chain reaction and western bolt assay were used to confirmed the expression of Bcl-2 and Bax、p53 in tumor tissue at mRNA and protein lever. Results：The weight and volume of tumor in Res group were less than those in the negative control group(P<0.01).RT-PCR and Western blot assay indicated Resveratrol of three different concentrations regulated the protein and mRNA expression of Bcl-2 and Bax、p53 in tumor tissue. At the same time ,the expression levels gradually changed as the concentration increased,the difference was significant (P<0.01) .Conclusion：Resveratrol inhibited the growth of pancreatic cancer Miapaca-2 cells xenograft. The effect may be related to the regulating of Bcl-2 and Bax、p53 at mRNA and protein lever.

Pancreatic neoplasms Neoplasm transplantation Rats,nude Tumor suppressor proteins@Resveratrol

*陜西省科技攻關項目(2011K13-01-15)

△西安交通大學第一附屬醫院肝膽外科

◇西安交通大學第二附屬醫院急診科

▲通訊作者

胰腺腫瘤 腫瘤移植 大鼠,裸 腫瘤抑制蛋白 @白藜蘆醇

R735.9

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2016.10.001