NBP對器官型腦片糖氧剝奪模型中細胞凋亡的影響

李世平， 董 梅， 郭彥芳， 程樹彬， 張祥建， 李春巖

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NBP對器官型腦片糖氧剝奪模型中細胞凋亡的影響

李世平， 董 梅， 郭彥芳， 程樹彬， 張祥建， 李春巖

目的 觀察正丁基苯酞(NBP)對乳大鼠大腦皮質(zhì)器官型腦片的氧糖剝奪模型(OGD)中細胞凋亡和線粒體電位的影響。方法 建立SD乳鼠大腦皮質(zhì)運動區(qū)的器官型腦片，SMI-32染色觀察錐體細胞。2 w后，隨機分為對照組(C組)和實驗組(T組)，T組在OGD干預30 min后給予不同劑量NBP，分為T0、T0.01、T0.1、T1、T10組，給NBP前和后1 h觀察PI染色；選擇T0組、T10組，觀察兩組在OGD 30 min、NBP 1 h、24 h、72 h、7 d等不同時間點PI染色變化。于NBP后1 h各T組進行JC-1線粒體膜電位檢測。結(jié)果 器官型腦片OGD 30 min給予NBP 1 h后，C組和各T組PI染色可見不同亮度紅色熒光，各T組熒光強度均大于C組，熒光強度與NBP濃度(0～10 μmol/L范圍內(nèi))呈負相關，各T之間組及與C組相比差異有顯著性(P<0.05)；T0組和T10組在OGD 30 min均出現(xiàn)明顯細胞凋亡，兩組無顯著性差異。復氧復糖后隨時間延長T0組細胞凋亡增加，T10組逐漸減少，差異顯著(P<0.05)；C組和各T組JC-1線粒體檢測試劑盒染色可見OGD 30 min，復氧復糖1 h后，紅色熒光/綠色熒光(R/G)的值明顯減小，R/G的值與NBP濃度呈正相關，各T組R/G值均小于C組，差異顯著(P<0.05)。結(jié)論 OGD模型可模擬缺血性腦損傷的病理變化，重復性良好；NBP對缺血性腦損傷導致的急性和遲發(fā)性細胞凋亡均具有保護作用；NBP對腦片損傷后線粒體電位的耗散有阻止作用，且與劑量相關。

器官型腦片； OGD； 正丁基苯酞； 細胞凋亡； PI染色

缺血性腦卒中的致死致殘作用嚴重威脅著患者的生活質(zhì)量。神經(jīng)元的缺血損傷和凋亡與患者神經(jīng)功能恢復關系密切，挽救神經(jīng)元損傷和凋亡對改善患者預后至關重要。

器官型腦片氧糖剝奪模型(oxygen and glucose deprivation，OGD)保存了與在體組織非常接近的細胞構(gòu)成和各種生理功能，培養(yǎng)條件和干預方式可準確控制和便于操作[1]，避免了血腦屏障和動物模型側(cè)枝循環(huán)的個體差異等因素影響，且一些性狀指標可在活體狀態(tài)下連續(xù)觀察，因此應用逐漸增多[2]。

正丁基苯酞(n-butyl phthalide，NBP)是芹菜甲素的人工合成消旋體，研究表明其具有改善腦缺血后能量代謝、保護線粒體、縮小梗死面積、改善腦缺血后神經(jīng)功能[3～5]等。本研究旨在建立乳鼠大腦皮質(zhì)體外培養(yǎng)的OGD模型，應用SMI染色、PI染色和JC-1染色等方法，觀察NBP對OGD誘發(fā)的腦片急性損傷和遲發(fā)性細胞凋亡的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑和器材 實驗動物為出生后5～7 d的SD乳鼠(河北醫(yī)科大學動物中心提供)，雌雄不限。實驗試劑包括正常培養(yǎng)液：50%MEM+25%馬血清+25%Hank’s平衡液(三種均購自Gibco公司)+葡萄糖，無糖培養(yǎng)液同上述成分不加葡萄糖，Geys平衡鹽溶液，DMSO，Propidium iodide(Sigma)，單克隆小鼠抗非磷酸化神經(jīng)絲單克隆抗體(SMI-32，Stemberger Monoclonals)，線粒體膜電位檢測試劑盒JC-1(碧云天生物技術(shù)研究所，C2006)，正丁基苯酞原料藥(NBP，石藥集團恩必普藥業(yè)有限公司免費提供)等。實驗器材包括CO2培養(yǎng)箱(Sanyo，MCO-18AIC)，Mcilwain活組織切片機，插入式培養(yǎng)皿Millicell-CM insert(Millipore)，厭氧罐，空氣真空泵(天津奧特塞恩斯儀器有限公司，AP-01D)，倒置熒光顯微鏡(Olympus)等。

1.2 大腦皮質(zhì)器官型腦片的制備及SMI-32染色 根據(jù)參考文獻[6，7]，選用5～7 日齡SD乳鼠，快速剝離腦組織后留取頂葉皮質(zhì)并修整組織塊，用組織切片機連續(xù)切成350 μm厚冠狀切片，放置在insert培養(yǎng)皿內(nèi)，于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱孵育，箱內(nèi)持續(xù)通入5%CO2和95%空氣的混合氣體，每周換液兩次。分別在培養(yǎng)1 w、2 w、3 w、4 w時，對腦片進行SMI-32染色，觀察錐體細胞生長并計數(shù)。

1.3 腦片OGD建立及NBP干預 取培養(yǎng)2 w腦片，隨機分為對照組(C組)和實驗組(T組，分為T0、T0.01、T0.1、T1、T10組)，每組9片。各T組更換無糖培養(yǎng)液(含PI 1 μg/ml)，置于密閉厭氧培養(yǎng)罐中，用真空泵抽出罐內(nèi)空氣，充入5%CO2+95%氮氣混合氣體，制備腦片OGD模型，于培養(yǎng)箱孵育30 min后取出，添加不同劑量NBP(0、0.01、0.1、1.0、10 μmol/L)，正常條件孵育1 h。C組同時更換兩次正常培養(yǎng)液(含PI 1 μg/ml)，正常條件孵育。NBP為油狀液體，提前以二甲基亞砜(DMSO)溶解稀釋。

1.4 腦片PI染色 使用時將PI染料加入培養(yǎng)液稀釋為1 μg/ml終濃度，孵育C組和各T組腦片20 min，在倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照，然后使用Image-Pro Plus 1.7軟件處理，計算照片熒光強度值。因腦片厚度不同可能導致背景熒光差異，需對熒光值進行矯正。設定測得值為Gm，那么最終的值G=G/G0·G0cont-G cont，其中G0是實驗腦片OGD之前所測值，G0cont是對照組在OGD之前所測得的平均值，G cont是對照組在處理的各個時間點所測得的平均值[8]。

1.5 JC-1線粒體檢測試劑盒染色 配置染色工作液：取適量JC-1(200X)，按照每50 μl JC-1加入8 ml超純水的比例稀釋JC-1，充分溶解混勻，再加入2 ml JC-1緩沖液(5X)，混勻即可。吸除insert培養(yǎng)皿中舊培養(yǎng)液，加入1 ml預溫至37 ℃新培養(yǎng)液。加入1 ml JC-1染色工作液，充分混勻，放入培養(yǎng)箱37 ℃孵育20 min。孵育期間，將適量JC-1染色緩沖液(5X)稀釋為JC-1染色緩沖液(1X)，并放至冰浴。腦片孵育結(jié)束后，用JC-1染色緩沖液洗滌，加入1 ml培養(yǎng)液，分別在倒置熒光顯微鏡紅色熒光和綠色熒光設置下觀察、拍照，并使用Image-Pro Plus 5.1軟件處理圖片，計算紅綠熒光強度比值。陽性對照的設置：采用試劑盒中提供的CCCP(10 μmol/L)按照1∶1000比例加入培養(yǎng)液，孵育腦片20 min，后按照上述方法加入JC-1，并在倒置熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié) 果

2.1 器官型腦片錐體細胞SMI-32免疫組化染色計數(shù) 腦片在體外培養(yǎng)存活良好，鏡下觀察可見腦片體積逐漸增大，變薄，透光度增加，皮質(zhì)和皮質(zhì)下結(jié)構(gòu)分界清晰，培養(yǎng)4 w時仍健康存活。培養(yǎng)1 w、2 w、3 w、4 w腦片進行SMI-32免疫組化染色，可見一層SMI-32陽性的細胞排列整齊，與皮質(zhì)表面平行，每個細胞胞體呈橢圓形或錐形，每個細胞有一個長的頂樹突伸向皮質(zhì)。隨著培養(yǎng)時間延長，細胞排列結(jié)構(gòu)層逐漸清晰，數(shù)目并無明顯改變(見表1、圖1)。

表1 腦片錐體細胞在不同培育時間點數(shù)量

各時間點錐體細胞數(shù)無統(tǒng)計學差異 (P>0.05)

圖1 A、B、C、D分別為1 w、2 w、3 w、4 w不同時間點SMI-32陽性錐體細胞

圖2 OGD后不同濃度NBP干預，PI染色(A：對照組；B：OGD 30 min；C：NBP 0.01 μmol/L；D：NBP 0.1 μmol/L；E：NBP 1 μmol/L；F：NBP10 μmol/L)

圖3 T0組熒光隨時間延長亮度增加(A：對照組；B：OGD 30 min；C：T0 1 h；D：T0 24 h；E：T0 72 h；F：T0 7 d)

圖4 T10組熒光隨時間延長亮度降低(A：對照組；B：OGD 30 min；C：T10 1 h；D：T10 24 h；E：T10 72 h；F：T10 7 d)

圖5 腦片OGD 30 min后，恢復正常氧糖含量并分別給予不同濃度NBP的PI染色值P<0.05

圖6 腦片OGD 30 min后，恢復正常氧糖含量，觀察T0、T10不同時間的PI染色值，T0染色值隨時間遞增，T10染色值隨時間遞減，P<0.05)

圖7 器官型腦片OGD 30 min后，加入不同濃度NBP，復氧復糖1 h后，進行JC-1線粒體檢測試劑盒染色，可見T組R/G值小于C組，各T組比值有差異(P<0.05)

2.2 培養(yǎng)腦片OGD模型及藥物干預的PI染色

2.2.1 各T組PI染色 制備器官型腦片OGD 30 min后，恢復正常氧糖含量并分別給予不同濃度NBP 1 h，與C組相比，各T組均可見到不同強度的紅色熒光，與NBP濃度呈負相關，各組之間差異均有統(tǒng)計學意義(見圖2、圖5)。

2.2.2 T0、T10組PI染色 器官型腦片OGD 30 min后，恢復正常氧糖含量分別加入NBP(0 μmol/L，10 μmol/L)，觀察不同的時間(OGD 30 min，NBP+再灌注1 h、24 h、72 h、7 d)PI染色，可見兩組在OGD 30 min后均出現(xiàn)了明顯的細胞凋亡，差異無顯著性，T0組隨時間延長細胞凋亡明顯增加。T10組隨時間延長，PI染色逐漸減少。兩組各時間點之間差異均具有統(tǒng)計學意義(見圖3、圖4、圖6)。

2.3 JC-1線粒體檢測試劑盒染色 器官型腦片OGD 30 min后，恢復正常條件并加入不同濃度NBP，復氧復糖1 h后，進行JC-1線粒體檢測試劑盒染色，可見各T組R/G值均小于C組，各T組隨NBP濃度增高，R/G值明顯增高，兩者呈正相關(見圖7)。

3 討 論

離體的腦片相對于在體實驗和細胞實驗，避免了血腦屏障、離子濃度變化、體溫、pH值等個體差異的影響，保持了神經(jīng)元與其他細胞的相互關系和神經(jīng)突觸回路等，能夠有效地研究缺血性腦損傷。本實驗選擇了出生后5～7 d的SD乳鼠大腦運動皮質(zhì)制備器官型腦片，采用Millicell膜插件的方式培養(yǎng)，保證營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的供應，成功率高，操作簡便。本實驗選用體外培養(yǎng)2 w時進行模型建立及藥物干預，更接近于成年鼠的神經(jīng)元對刺激損傷的變化。

本實驗采用的OGD模型模擬了實際缺血過程中氧和葡萄糖的耗竭過程，使腦組織的病理改變盡可能接近在體情況下的實際變化。建立OGD模型時，本實驗選用了厭氧培養(yǎng)罐作為密閉容器，該容器密閉性好，有單獨閥門，可控制氣體進出，且?guī)в袣鈮罕?，可直接觀察抽出和充入氣體的量，使氮氣和CO2量相對穩(wěn)定，體積小可直接放進培養(yǎng)箱孵育，最大限度維持實驗過程中溫度恒定，試驗后可盡快恢復至正常培養(yǎng)條件。

NBP是我國研發(fā)的國家一類新藥，對局部缺血腦組織具有改善局部血液微循環(huán)，促進局部毛細血管生長，保護線粒體等功能。林劍鋒和馮亦璞在動物大腦中動脈閉塞(MCAO)模型的研究中發(fā)現(xiàn)，MCAO術(shù)后2 h進行不同劑量NBP灌胃，能明顯減少腦梗死的體積，改善神經(jīng)功能，并有很好的量效關系。表明NBP對遲發(fā)型細胞損傷具有保護作用[9]。

PI是一種穩(wěn)定的熒光染料，僅在細胞死亡或凋亡過程中，細胞膜遭到破壞時進入細胞，PI對神經(jīng)細胞無毒性損傷，與脫氧核糖核酸(DNA)緊密結(jié)合后被激發(fā)出明亮紅色熒光。本研究中PI染色表明OGD/再灌注后，發(fā)生急性細胞凋亡及遲發(fā)損傷，PI染色明顯；應用NBP后PI染色隨濃度的增加及應用時間的延長逐漸減弱，發(fā)生可逆性變化，提示NBP對損傷的細胞具有保護作用，可阻斷細胞凋亡過程的發(fā)生。

腦缺血的細胞損傷分為急性細胞壞死和遲發(fā)的細胞凋亡。近來報道，線粒體跨膜電位耗散發(fā)生于缺血早期，不能維持線粒體內(nèi)外膜之間的質(zhì)子H+梯度，呼吸鏈受到抑制，氧化磷酸化障礙，線粒體膜的結(jié)構(gòu)和通透性的改變，大量鈣離子，活性氧，細胞色素C等物質(zhì)釋放進入胞漿，從而激活casepase家族，細胞進入不可逆的凋亡過程[10]。同時由于ATP減少，細胞能量耗竭，不能維持正常的滲透壓和膜電位，蛋白質(zhì)合成受到抑制，甚至基因表達異常，進一步加速了凋亡的進程[11]。穩(wěn)定線粒體跨膜電位能夠減少細胞凋亡的發(fā)生。這對腦梗死體積和神經(jīng)功能預后有非常密切的關系，對臨床治療更有實際應用價值。

JC染色是一種以JC-1為熒光探針，快速靈敏地檢測細胞、組織或純化的線粒體膜電位變化的試劑盒，可以用于早期的細胞凋亡檢測。在線粒體膜電位較高時，產(chǎn)生紅色熒光，較低時，產(chǎn)生綠色熒光。通過JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變可以很容易地檢測到細胞膜電位的下降，同時也可以作為細胞凋亡早期的一個檢測指標。本研究中JC染色結(jié)果表明腦片損傷后存在線粒體電位的耗散在早期已經(jīng)出現(xiàn)，應用NBP干預后，可阻斷線粒體膜電位的降低，且這種作用與NBP濃度存在量效關系，呈正比，表明NBP可以通過保護線粒體膜電位的作用，減輕細胞凋亡過程。

本實驗觀察發(fā)現(xiàn)，NBP對OGD/復氧復糖誘導的腦片急性和遲發(fā)損傷均具有保護作用，且有明顯的量效關系。NBP(10 μmol/L)對遲發(fā)性損傷有明顯的保護作用，對腦組織損傷的預后具有明顯的改善作用，這一作用與NBP能夠保護線粒體，減少線粒體膜電位的耗散有關，但是具體的機制有待進一步研究。

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The effection of NBP on apoptosis of organotypic brain slices in the model of oxygen-glucose deprivation

LIShipin，DONGMei，GUOYanfang，etal.

(DepartmentofNeurology，KeyLaboratoryofNeurologyofHebeiProvince，TheSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050000，China)

Objective To establish the oxygen and glucose deprivation (OGD) model of organotypic brain slices of rat cerebral cortex and observe the effects of n-butyl phthalide (NBP) on apoptosis and mitochondrial membrane potential. Methods Culturing brain slices of SD rats on the membrane insert and observed the morphological changes of pyramidal cells by SMI-32 stain with immunohistochemistry. After being cultured two weeks in vitro，brain slices were divided into two groups：control group(group C) and test group(group T). Group T include five subgroup(T0、T0.01、T0.1、T1、T10) according to different concentrations of NBP(0，0.01μm，0.1 μm，1 μm，10 μm) to brain slices after treating with OGD 30 min. Brain slices were observed by PI dyeing before and after being given NBP 1 h with different concentrations. Then observing the brain slices in T0and T10dyeing by PI at different time (OGD 30min，NBP 1 h，24 h，72 h，7 d). Group C and each subgroups of T，treated by OGD and NBP in order (no PI)，were detected the mitochondrial membrane potential by JC-1 kits. Results Brain slices were treating with NBP 1 h after OGD 30 min，they showed different brightness of red fluorescence in control group and test group (T0、T0.01、T0.1、T1、T10) by PI staining. Compared with control group，the fluorescence intensity of each experimental subgroup were greater and negatively related to the concentration of NBP (P<0.05). Observing the apoptosis in slices of T0and T10at different time (OGD 30 min，NBP 1 h、24 h、72 h、7 d)，we found the number of cell death had no significant different at OGD 30 mim. After giving normal glucose and oxygen，the brain slices had increasing fluorescence intensity in T0and decreasing fluorescence intensity in T10with prolonged time (P<0.05). After OGD 30 min and returned to normal oxygen and glucose 1 h，the slices were detected by mitochondrial membrane potential detection kit(JC-1 kit). The value of red/green fluorescence of each group (C，T0、T0.01、T0.1、T1、T10) dramatic reduced correlated positively with dose of NBP. The value of each experimental group was smaller than the control group (P<0.05). Conclusion Treated with OGD，brain slices showed ischemic damage including acute cell death and delayed apoptosis. The model can be established easily. NBP had protective effect on ischemic brain. There is a dose-effect relationship between NBP and brain damage. There was dissipation of mitochondrial membrane potential in brain slices after OGD. NBP could prevent the decline of mitochondrial potential in dose-effect dependent way.

Organotypic brain slices； Oxygen and glucose deprivation； N-butyl phthalide； Apoptosis； PI staining

1003-2754(2016)01-0004-05

2015-11-01；

2015-12-16

(河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，神經(jīng)病學河北省重點實驗室，河北 石家莊 050000)

李春巖，E-mail：lichuny@126.com

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