回藥扎里奴思方聯合BMSCs移植對腦缺血再灌注大鼠BBB緊密連接蛋白的影響

劉敬霞， 任非非， 劉會賢， 劉 洋， 李 娟， 虎喜成

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回藥扎里奴思方聯合BMSCs移植對腦缺血再灌注大鼠BBB緊密連接蛋白的影響

劉敬霞1， 任非非1， 劉會賢2， 劉 洋2， 李 娟2， 虎喜成1

目的 觀察扎里奴思方聯合BMSCs移植對MCAO模型大鼠BBB上Occludin和Claudin mRNA表達的影響。方法 250只SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、扎方組、移植組和聯合組，除假手術組10只外，其余各組15只；線栓法制備MCAO模型，體外全骨髓貼壁法培養及擴增BMSCs；大鼠灌胃給藥[14.6 g/(kg·d)]，BMSCs懸浮液經頸內動脈移植入腦(2×106/200 μl)；移植后1 d、3 d、7 d、14 d取材，干濕重法檢測腦含水量，Real time-PCR技術檢測Occludin和Claudin mRNA表達。結果 模型大鼠腦含水量較假手術組增加(P<0.01)，Occludin和Claudin mRNA表達降低(P<0.01)；與模型組比較，扎方、移植及聯合各3 d、7 d、14 d組腦含水量降低(P<0.01)，各組各時間點Occludin和Claudin mRNA表達增高(P<0.01)；與移植組比較，扎方1 d組腦含水量降低(P<0.05)，3 d組Occludin mRNA表達增高(P<0.01)，7 d組表達降低(P<0.01)，扎方1 d組Claudin mRNA表達增高(P<0.05)，7 d、14 d組表達降低(P<0.01)，聯合各組腦含水量均降低，以1 d、14 d明顯(P<0.01)，各組Occludin和Claudin mRNA表達均增高(P<0.01)；扎方與聯合組比較，聯合各組腦含水量降低，以7 d、14 d組明顯(P<0.01，P<0.05)，Occludin和Claudin mRNA表達增高(P<0.01)；同組間比較，均以7 d組變化顯著，腦含水量呈先增后減趨勢，Occludin和Claudin mRNA表達呈先減后增趨勢，14 d有明顯改善(P<0.01)。結論 腦缺血再灌注損傷后BBB受損，通透性改變，腦水腫形成，以7 d最為明顯；扎里奴思方和BMSCs移植均可不同程度改善腦缺血后腦水腫程度，以二者聯合應用作用顯著，其機制可能與干預Occludin和Claudin mRNA動態表達有關。

腦缺血再灌注； 扎里奴思方； 骨髓間充質干細胞； Occludin mRNA； Claudin mRNA

腦缺血再灌注損傷(Cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI)可發生于多種腦血管疾病過程中，其病理生理機制是涉及多環節、多因素、多途徑損傷的復雜的酶促級聯反應。而腦內血腦屏障(blood brain barrier，BBB)通透性改變既是損傷后的結果，又是導致損傷進一步加重的重要因素[1]。緊密連接(tight junction，TJ)是存在于BBB上內皮細胞與毛細血管之間的復雜的細胞系統，是BBB的結構基礎，對維持BBB生理功能具有重要意義[2]。Occludin和Claudin是組成TJ的主要結構蛋白，是衡量TJ功能變化的重要指標[3]。研究顯示，Occludin和Claudin與BBB通透性的調節密切相關，其表達變化可作為衡量BBB損傷程度的標志[4，5]。

骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是位于骨髓內除造血干細胞之外的另一類非造血干細胞[6]，具有強大的增殖和多向分化潛能，已成為應用干細胞移植治療腦缺血損傷領域的熱點[7]。扎里奴思方是《回回藥方》中記載的治療腦病的常用方劑，具有芳香開竅，補腎活血功效，能顯著調控腦缺血后BBB通透性，改善腦組織損傷程度[8]。本研究擬以SD大鼠為研究對象，觀察CIRI大鼠腦內Occludin和Claudin的表達變化及應用扎里奴思方聯合BMSCs移植對其變化的影響，探討聯合應用治療腦缺血損傷的機制，為回醫藥聯合干細胞移植治療神經系統疾病的臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 雄性SD大鼠，250只，清潔級，(350±30) g，由寧夏醫科大學實驗動物中心提供，動物合格證號SCXK(寧)2009-0001；所有大鼠于同一動物房中飼養，溫度(26±1) ℃，濕度(50±10)%，光暗周期12 h/12 h，自由進食和飲水；常規環境適應性飼養7 d后進行實驗。

1.1.2 試劑和藥物 培養基DMEM/F-12(美國生命科技公司，批號1292607)，0.25%胰酶(美國HyClone，批號J130020)，胎牛血清(FBS，杭州四季青生物工程材料有限公司，批號051126)，青霉素、鏈霉素(美國Solarbio，批號20110726)，TRIzol(美國Invitrogen，批號15596-026)，cDNA第一鏈合成試劑盒(美國Thermo Fisher，批號K1622)，SYBR Green Real time PCR Master Mix(日本TOYOBO)，Agarose(西班牙Biowest，批號111860)，50×TAE電泳緩沖液(南京凱基生物科技發展有限公司，批號KGM020)，氯仿(南京化學試劑有限公司，批號11012710115)，異丙醇(南京化學試劑有限公司，批號12021023041)，DEPC處理70%乙醇(南京凱基生物科技發展有限公司，批號KGDN6)，0.1%DEPC Water(南京凱基生物科技發展有限公司，批號KGDN4500)，尼龍線栓(北京沙東生物科技有限公司，批號2636-4A)，水合氯醛(國藥集團化學試劑有限公司，批號20100709)，氨芐青霉素鈉(美國Amresco，批號0339)。扎里奴思方出自《回回藥方》，組成為：阿你松 (安息香)3 g、法里公(小茴香)12 g、兀沙吉(乳香)12 g、法忒剌撒里榮(當歸)12 g、木里(沒藥)12 g、撒法郎(紅花)12 g、阿咱兒公(牡丹皮)9 g、拆不牙剌 (蘆薈)12 g、伯思八牙(水龍骨)12 g、祖伐(懷牛膝)24 g、撒的知(肉桂)6 g、膃肭臍(海狗腎)12 g、阿夫忒蒙(菟絲子)12 g、哈咱卜咱里剌(石菖蒲)12 g。制劑由寧夏醫科大學附屬回醫中醫院制劑室提供，煎煮濾取并濃縮藥液至生藥濃度為1.46 g/ml，4 ℃保存備用。

1.1.3 儀器 PM-10AD-倒置相差顯微鏡(日本Olympus)，T02323-二氧化碳培養箱(美國Sheldon Plumbing Inc. )，YP1201N-電子天平(上海精科天平儀器廠)，BL310/BL21S-分析天平(德國Sartorius)，80-2-臺式低速離心機(上海醫療器械股份有限公司醫療設備廠)，ST16R-高速冷凍離心機(美國Thermo Sorvall)，XW-80A-渦旋振蕩器(其林貝爾儀器制造有限公司)，UV-2450-紫外光度儀(日本SHIMADZU)，TC9600-G-普通梯度PCR儀(美國Labnet MultiGene Gradient)，DA7600-熒光定量PCR循環儀(中山大學達安基因股份有限公司)，DYY-6B-核酸電泳儀(北京市六一儀器廠)，Gel Doc XR-凝膠成像儀(美國BIO-RAD)，MDF-U7386S-sanyo超低溫冰箱(日本三洋公司)，CU-420-電熱恒溫水槽(上海恒科技公司)，HS-840U-超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)，GZX-DH·500-BS-電熱恒溫干燥箱(上海昕儀儀器儀表有限公司)，YY0088-92-微量進樣器(江蘇欣悅玻璃儀器有限公司)，YXQ-LS-50-立式壓力鍋(上海博訊實業有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 局灶性腦缺血再灌注大鼠模型制備 參照Longa等[9]的改良線栓法制備大鼠大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型。10%水合氯醛ip麻醉大鼠，待麻醉完全后，仰臥位固定大鼠，常規消毒手術視野區皮膚，頸前正中切開皮膚，鈍性分離左側頸總動脈(CCA)；分離頸內(ICA)、頸外(ECA)動脈，穿線備用；結扎ECA近心端和遠心端，將ECA從中間剪斷；結扎翼腭動脈(PA)，于ECA近CCA分叉處剪一小口，將線栓通過小口穿入ICA并緩慢前向推進，直至有阻力感為止，線栓插入深度約為(18.0±0.5) mm；插線成功后留出線栓殘端約1 cm，結扎ECA剪口處，縫合皮膚，并在切口處滴注青霉素鈉溶液，以防感染。缺血2 h后拆線并緩慢拔出線栓(但未全部拔出ECA)以進行缺血再灌注，后縫合皮膚。假手術組只分離CCA，ICA及ECA，不插入線栓。手術過程中保持大鼠肛溫(37.0±0.5) ℃，保持室溫(26±1) ℃。術后參考Longa等[9]的5級4分法對模型進行評分：(1)0分，正常，無神經功能缺損癥狀。(2)1分，不能完全伸展病變對側上肢。(3)2分，出現Horner征，行走時向病變對側旋轉。(4)3分，行走時向病變對側傾倒。(5)4分，無自發活動伴意識降低。1～3分者為成功模型。若術中意外死亡、缺血再灌注24 h內死亡、線栓插入過深造成蛛網膜下腔出血的大鼠被剔除。

1.2.2 BMSCs的培養、擴增和移植

(1)懸液收集：將2月齡雄性SD大鼠(250 g)斷頸處死，全身浸泡于75%乙醇中消毒10 min。無菌條件下取出股骨、脛骨，剔除表面附著的組織，PBS清洗3次；剪掉股骨、脛骨的骨垢端，露出骨髓腔，用DMEM/F-12培養基(含肝素及青、鏈霉素)10 ml 反復沖洗骨髓腔，反復吹打后用200目細胞過濾篩過濾，1000 r/min 離心5 min，棄上清；加入含10%FBS的DMEM/F-12完全培養基5 ml 吹打混勻，重懸，收集BMSCs單細胞懸液；(2)培養、擴增：將收集到的BMSCs單細胞懸液以1×108/L細胞濃度接種于25 cm2的培養瓶中，置于37 ℃、濃度為5%的CO2、飽和濕度的培養箱中培養；3～4 d 換液1次，棄去未貼壁細胞后繼續培養，倒置顯微鏡下逐日觀察細胞形態及生長；待瓶底貼壁細胞達80%～90%時，棄去瓶內培養基，PBS緩慢洗滌細胞，以清除培養瓶內混雜細胞；加入0.25%胰酶2 ml 消化，于倒置顯微鏡下觀察，待貼壁細胞明顯收縮，間隙變大，大部分細胞形態變圓并開始脫落時，加入完全培養基終止消化，結束原代培養；反復吹打培養基，收集細胞懸液至15 ml 離心管中，1000 r/min，離心5 min，棄上清，加入含10%FBS的DMEM/F-12完全培養基重懸，按1：2比例進行傳代培養。逐日觀察細胞生長狀態；(3)重懸、計數：收集第3代細胞，如前法進行消化、離心及PBS漂洗3次，進行細胞重懸并計數，調整細胞濃度至每0.2 ml PBS含細胞數為2×106個備用；(4)移植：建立MCAO模型24 h后，拆線并將剩余線栓殘端全部拔出ECA，沿ECA切口將直徑0.7 mm密閉式靜脈留置針管緩慢插入ECA，緩慢向前推進至ICA前端并結扎；用微量移液器抽取BMSCs單細胞懸液200 μl，對移植組和聯合組大鼠經留置針管由缺血同側的頸內動脈緩慢移植入腦，后拔出留置針，徹底結扎ECA殘端，縫合皮膚。

1.3 分組與用藥

1.3.1 分組 大鼠按隨機數字表法分為假手術組、模型組、扎里奴思方組(簡稱扎方組)、BMSCs移植組(簡稱移植組)、BMSCs移植聯合扎里奴思方組(簡稱聯合組)；后4組根據取材時間點不同又各分為1 d、3 d、7 d、14 d，每個時間點組大鼠15只，假手術組10只大鼠。

1.3.2 用藥 假手術組及模型組以同等體積生理鹽水灌胃(ig)；模型組頸內動脈給予和移植組同等體積的生理鹽水；扎方組于術前4 dig(大鼠ig用藥的劑量根據人與大鼠等效劑量換算公式計算，ig體積按照100 g大鼠ig 1 ml 計算，生藥用量為[14.6 g/(kg·d)]，配成的混懸液濃度為1.46 g/ml)，再灌注后24 h頸動脈給予生理鹽水200 μl；移植組于術前4 d給予和扎方組同等體積的生理鹽水ig，再灌注后24 h頸內動脈給予BMSCs懸浮液200 μl(細胞數為2×106個)；聯合組于術前4 d給予扎里奴思方ig，再灌注后24 h頸內動脈給予BMSCs懸浮液200 μl。大鼠于術前12 h禁食，不禁水。

1.4 取材 假手術組于術后14 d取材，其余各組根據時間點分別于頸內動脈用藥后1 d、3 d、7 d、14 d取材；麻醉大鼠，4%的多聚甲醛溶液進行灌注固定，斷頭取腦，用4 ℃生理鹽水沖洗3次。于冰盤上迅速分離大腦半球，取左側半球，自額極向后冠狀切取3 mm厚腦組織，待測腦組織含水量；再向后冠狀切取約3 mm厚腦組織切片，取切片皮質及半暗帶腦組織50 mg，置入液氮內保存，待提取總RNA。

1.5 指標檢測

1.5.1 腦組織含水量測定 斷頭取材后，切取的腦組織迅速用電子天平稱取濕重，后放入電熱恒溫干燥箱(100±2) ℃中干燥24 h，稱取干重。按如下公式計算。腦組織含水量=(腦濕重-腦干重)/腦濕重×100%。

1.5.2 實時熒光定量PCR檢測 取切取的缺血側腦組織置入1.5 ml EP管中，利用TRIzol試劑盒提取總RNA，紫外光度儀測定RNA含量。采用cDNA第一鏈合成試劑盒將總RNA反轉錄成cDNA。取反轉錄產物采用SYBR Green Real time PCR Master Mix試劑盒進行實時熒光定量PCR反應。以GAPDH為內參，采用20 μl 反應體系，各引物序列如下：GAPDH：F 5’-GGCCTTCCGTGTTCCTACC-3’，R 5’-CGCCTGCTTCACCACCTTC-3’，103bp；Occludin：F 5’-CCAATCATTATGCACCAAGC-3’，R 5’-GAATTTCGTCTTCCGGGTAA-3’，201 bp；Claudin-5：F 5’-GAAATTCTGGGTCTGGTGCT-3’，R 5’-ATATTGTGGTCCAGGAAGGC-3’，101bp?？偡磻w系包括cDNA 1 μl，SYBR Green 2X Real time PCR Master Mix 10 μl，上下游引物各1 μl，0.1% DEPC Water 7 μl。放入熒光定量PCR循環儀，反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 40 s，40 cycle；溶解曲線95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，60.3 ℃ 15 s，60.6 ℃ 15 s。目的基因表達量采用ΔΔCT法進行分析。

2 結 果

2.1 腦組織含水量 與假手術組比較，模型組各時間點腦組織含水量增加(P<0.01)。與模型組比較，扎方、移植和聯合各3 d、7 d、14 d組腦組織含水量降低(P<0.01)。與移植組比較，扎方1 d組腦組織含水量降低(P<0.05)，其余各組變化無統計學意義；聯合各組腦組織含水量降低，以1 d、14 d組降低顯著(P<0.05，P<0.01)。扎方組與聯合組比較，聯合各組腦組織含水量降低，以7 d、14 d組降低顯著(P<0.05，P<0.01)。同組別不同時間點比較，模型、扎方、移植及聯合各7 d組腦組織含水量均較1 d、3 d、14 d組增加(P<0.01)，模型、聯合各14 d組較1、3 d組有顯著性差異(P<0.05，P<0.01)，扎方14 d組較1 d組降低(P<0.01)，移植14 d組較1 d、3 d組變化無統計學意義(見表1)。

2.2 腦組織Occludin mRNA表達 與假手術組比較，模型組各時間點Occludin mRNA表達顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，扎方、移植及聯合各組Occludin mRNA表達顯著增加(P<0.01)。與移植組比較，聯合各組及扎方3 d組Occludin mRNA表達增加(P<0.01)，扎方7 d組表達降低(P<0.01)。扎方組與聯合組比較，聯合各組Occludin mRNA表達增加(P<0.01)。同組別不同時間點比較，模型、扎方、移植及聯合各組Occludin mRNA表達均成先減后增趨勢，扎方、聯合各7 d組較1 d、3 d、14 d組降低(P<0.01)，模型7 d組較1 d、3 d組降低(P<0.01)，移植7 d組較14 d組降低(P<0.05)，模型14 d組較3 d組降低(P<0.01)，扎方、聯合各14 d組較3 d組增加，變化無統計學意義(P>0.05)(見表2、圖1)。

2.3 腦組織Claudin-5 mRNA表達 與假手術組比較，模型組各時間點Claudin-5 mRNA表達顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，扎方、移植及聯合各組Claudin-5 mRNA表達顯著增加(P<0.01)。與移植組比較，聯合各組及扎方1 d組Claudin-5 mRNA表達增加(P<0.01，P<0.05)，扎方7 d、14 d組表達減少(P<0.01)。扎方組與聯合組比較，聯合各組Claudin-5 mRNA表達增加(P<0.01)。同組別不同時間點比較，模型、移植及聯合各3 d組Claudin-5 mRNA表達均較1 d組增加，扎方3 d組較1 d組降低，差異均無統計學意義(P>0.05)，各7 d 組Claudin-5 mRNA表達均最低，模型、扎方各7 d組均較1 d、3 d、14 d減少(P<0.01)，移植7 d組較14 d組減少(P<0.01)，聯合7 d組較3 d、14 d減少(P<0.01，P<0.05)(見表3、圖1)。

t為時間點；與假手術組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.05，4)P<0.01；與移植組比較：5)P<0.05，6)P<0.01；扎方組與聯合組比較：7)P<0.05，8)P<0.01；與同組別1 d組比較：9)P<0.05，10)P<0.01；與同組別3 d組比較：11)P<0.05，12)P<0.01；與同組別7 d組比較：13)P<0.05，14)P<0.01 (表2、表3同)

表2 扎里奴思方聯合BMSCs對大鼠腦組織Occludin mRNA的影響

表3 扎里奴思方聯合BMSCs對大鼠腦組織Claudin-5 mRNA的影響

Occludin mRNA

Claudin-5 mRNA

圖1 Occludin及Claudin-5 mRNA的real time-PCR擴增曲線及溶解曲線

3 討 論

BBB是位于腦內血管與組織間的一個復雜結構，主要由腦毛細血管內皮細胞及其間的TJ、基膜和周細胞、星形膠質細胞終足形成的膠質膜和細胞外基質組成，是腦組織與周圍環境進行物質交換的通道，對腦內環境穩態的維持至關重要[10]。研究表明[11]，TJ是維持BBB完整性的重要結構基礎，其結構和功能的異常對BBB通透性變化起重要作用。TJ由多種蛋白組成，主要包括胞漿黏附蛋白ZO家族(zonula occludens)、跨膜蛋白和細胞骨架蛋白三類[12]?？缒さ鞍子职ㄒШ系鞍?Occludin)、閉合蛋白(Claudin)和連接黏附分子(junctional adhesive molecule，JAM)三種膜蛋白[13]。

Occludin是1993年由Furuse等[14]最先分離出的第一個TJ跨膜蛋白，由504個氨基酸組成，相對分子質量為65 kDa。Terry等[15]研究證實，Occludin與腦微血管內皮細胞的“屏障”作用密切相關。Claudin是1998年Furuse等發現的另一類新的TJ跨膜蛋白[16]，目前已發現24個Claudin跨膜蛋白成員，相對分子質量在18～27 kDa之間，序列同源性約12.5%～69.7%。研究[17，18]表明，在腦微血管內皮系統中，Claudin-3和Claudin-5含量最高，調節Claudin特別是Claudin-5對于BBB通透性起重要作用。另有研究[19]發現，Occludin和Claudin-5兩種蛋白表達在腦缺血再灌注損傷后4 h減少，于損傷后1～2 d逐漸恢復，同時也證實二者表達降低加速了腦缺血后BBB的損傷。本研究顯示，CIRI后1 d，大鼠腦組織含水量開始增加，并隨時間延長呈上升趨勢，在損傷后7 d達高峰，后逐漸降低，但14 d時仍高于1 d水平，表明CIRI后BBB受損，通透性改變，大量水分進入腦組織形成腦水腫，加重腦損傷程度。Occludin mRNA和Claudin-5 mRNA轉錄水平在CIRI后明顯降低，并于損傷后7 d 降至最低，之后逐漸上調，14 d仍低于1 d、3 d，提示CIRI引起Occludin mRNA和Claudin-5 mRNA轉錄水平的降低是導致BBB通透性改變，損傷程度加重的途徑之一。

BMSCs是存在于骨髓中的一類具有高度自我更新能力和多向分化潛能的成體干細胞，且具有易于體外分離和培養、免疫原性低的特性，能和腦組織整合并定向遷移、分化以促進受損神經細胞再生和修復[20]。因此，BMSCs被認為是干細胞移植治療腦缺血損傷理想的種子細胞，利用BMSCs移植成為促進損傷后神經元結構和功能恢復的有效途徑[21]。但腦內BBB的屏障作用限制了BMSCs進入腦內的數量，影響其治療作用的發揮[22]。如何有效調控BBB通透性以促進BMSCs進入腦內并向受損部位遷徙和歸巢成為應用BMSCs移植治療CIRI研究的熱點。

芳香開竅類藥物氣味辛香，善于走竄，以開竅醒神、啟閉回蘇為應用特點，研究[23]表明，該類藥物能通過多個途徑調控BBB通透性，發揮腦保護作用。扎里奴思方出自《回回藥方》，由安息香、小茴香、乳香、當歸、沒藥、紅花、牡丹皮、蘆薈、水龍骨、懷牛膝、肉桂、海狗腎、菟絲子、石菖蒲等藥組成，原書[24]論其“可開竅，凈其渾身厚濁風痰，治療痰盛弱病”，具有芳香開竅、補腎活血功效，其配方中的“香藥”應用更是切中中風后邪蒙清竅、風痰阻竅的病機變化，是回族醫學治療腦梗死的常用方劑之一。前期研究[8]顯示，該方能有效促進腦缺血后神經功能恢復，減輕腦水腫，減少IgG表達，發揮BBB調控作用。本實驗將該方與BMSCs聯合應用，結果顯示，聯合各組腦組織含水量均較扎方、移植組降低，以7 d、14 d降低明顯，聯合組各時間點Occludin和Claudin-5各mRNA轉錄水平均較該兩組增高。同時，扎方組大鼠腦含水量、Occludin和Claudin-5各mRNA轉錄水平均較模型組有不同程度改善，表明該方能有效調控CIRI后BBB通透性，促進BMSCs進入腦內發揮腦保護作用，且以兩者聯合作用顯著。提示兩者聯合在降低腦缺血損傷后腦水腫方面作用顯著，其機制可能與影響BBB上TJ跨膜蛋白Occludin和Claudin-5的動態表達有關。

綜上所述，扎里奴思方聯合BMSCs移植對CIRI大鼠腦內BBB破壞具有協同保護作用，其機制可能與上調TG跨膜蛋白Occludin和Claudin-5各mRNA轉錄水平有關。

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Effect of Hui Medicine Zhali Nusi Recipe(ZLNS) Combined with Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Transplantation on Expression of Tight Junction Occludin and Claudin mRNA of Blood-brain Barrier in Rats after Cerebral Ischemia Reperfusion Injury

LIUJingxia，RENFeifei，LIUHuixian，etal.

(TraditionalChineseMedicineSchoolofNingXiaMedicalUniversity，Yinchuan750004，China)

Objective To observe the effect of Hui Medicine Zhali Nusi Recipe(ZLNS) combined with bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs) transplantation on expression of tight junction Occludin and Claudin mRNA of blood brain barrier(BBB) in middle cerebral artery occlusion(MCAO) rats. Methods SD rats were divided randomly into Sham-operated，model，ZLNS，BMSCs transplantation and ZLNS combined with BMSCs groups；MCAO model was duplicated with nylon thread，BMSCs were cultured and amplified by the whole bone marrow adherence method；Drugs were given to the rats by intragastric administration[14.6 g/(kg·d)]，BMSCs suspension solution were transplanted into brain through carotid artery(2×106/200 μl)；Rat brain was taken out at 1，3，7，14 days after transplantation；Brain water content(BWC) was detected by dry-weight assay，Occludin and Claudin mRNA were detected by real time-PCR. Results The BWC in model groups were obviously increased than that of the sham-operated groups(P<0.01) and the expression of Occludin and Claudin mRNA were obviously decreased(P<0.01)；Compared with the model groups，the BWC at 3、7、14 days in ZLNS，transplantation and combination groups were decreased obviously(P<0.01)，the expression of Occludin and Claudin mRNA in each groups were significantly increased(P<0.01)；Compared with the transplantation groups，the BWC at 1 day in ZLNS group was decreased(P<0.05)，the expression of Occludin mRNA at 3 day in ZLNS group was obviously increased(P<0.01) and was significantly decreased at 7 day(P<0.01)，the expression of Claudin mRNA at 1 day in ZLNS group was increased(P<0.05) and were obviously decreased at 7、14 days(P<0.01)，the BWC in each combination groups were decreased，and were obvious at 1，14 days groups(P<0.01)，the expression of Occludin and Claudin mRNA in each combination groups were significantly increased(P<0.01)；Compared with the ZLNS groups，the BWC were decreased in each combination groups and also obvious at 7、14 days groups(P<0.01，P<0.05)，the expression of Occludin and Claudin mRNA were significantly increased(P<0.01)；Compared with the same group，all changes were remarkable in 7 days group，the BWC was increased firstly and then decreased，the expression of Occludin and Claudin mRNA were opposite to it. All the indicators were improved in 14 days group. Conclusion The BBB was damaged and the permeability of BBB changed after cerebral ischemia reperfusion，the brain edema was formed and was remarkable at 7 days group. Both ZLNS and BMSCs transplantation can improve the brain edema in different extent，the effect is superior by the combination of them，and its mechanism may be related to the regulation of the dynamic expression of Occludin and Claudin mRNA.

Cerebral ischemia reperfusion； Zhali Nusi Recipe； Bone marrow mesenchymal stem cells； Occludin mRNA； Claudin mRNA

1003-2754(2016)01-0054-06

2015-09-29；

2015-11-30

國家自然科學基金項目(No.81260569)

(1.寧夏醫科大學中醫學院，寧夏 銀川 750004；2.寧夏醫科大學附屬回醫中醫院，寧夏 吳忠 751100)

劉敬霞，E-mail：ljx199566@163.com

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