急性飲酒對小鼠海馬CA1區鋒電位的影響*

俞荷娟，張雅檬，張言，錢志余，陶玲，李韙韜

（南京航空航天大學自動化學院，南京210006）

1 引 言

酒精（乙醇）是一種親神經的麻醉劑，慢性酗酒和暴飲性飲酒均可引起腦損傷，過去幾十年有關酒精導致腦損傷的研究[1-3]多集中在慢性酗酒引起酒精中毒，比如酒精濫用和酒精依賴等。Oscar等認為[4-5]酒精在細胞水平上以各種方式直接影響神經系統尤其是大腦的功能，一次大量飲酒導致急性酒精中毒導致的急性腦損傷具有獨特的生物化學和中樞神經系統變化[6-7]。海馬是人類與哺乳動物大腦都存在的重要腦區，長期研究結果表明，海馬腦區與學習、記憶、空間定位等功能密切相關。研究發現，一次性大量飲酒可以導致小鼠大腦氧自由基相關生物學標志物水平的變化，表現為降低降解自由基酶的活力和升高氧自由基的水平，從而可能造成腦損傷[8-9]。

鋒電位（Spike）是細胞外記錄到的神經元單細胞動作電位。神經元是神經活動的最基本單位，且大多數神經元之間通過鋒電位的發放進行信息的交流和傳遞[10]。神經系統中，由于動作電位（即鋒電位）的發放有或無、傳輸無衰減的數字信號特性，神經元通過對鋒電位進行編碼來表征信息，如發放速率，發放間隔等。在腦功能（知覺，運動）方面，鋒電位的發放模式與行為密切相關。此外，鋒電位的發放紊亂也會導致腦部的一些疾病（癲癇，抑郁癥等）。因此，研究神經元的鋒電位發放是研究神經系統信息處理機制的關鍵。

隨著人們對大腦的認識越來越深入，各種研究方式和手段也在不斷的進步。其中電生理技術的應用，便為許多腦神經活動的研究提供了重要的依據。為了獲取信息在神經元網絡中的時間空間響應模式，必須要使用高分辨率的檢測技術。胞外記錄是目前從活體動物的神經組織中獲得這種精確信息的最好工具[11]。通過置于神經元細胞體附近的電極，可以獲得時間分辨率為毫秒精度的動作電位發放信息，具有高時間空間分辨率的特點。此外，通過植入大量電極，在不對組織造成很大傷害的情況下，還能夠獲得一定空間范圍內數百個神經元的活動變化規律。

本研究通過在麻醉狀態下的小鼠海馬CA1區植入記錄電極，穩定采集并記錄到較長時間、較為穩定的微幅級鋒電位信號，并使用神經電信號分析軟件對急性飲酒前和急性飲酒后的鋒電位進行了放電頻率、鋒電位發放時間間隔等多項指標的分析。本研究觀察小鼠急性飲酒前及急性飲酒后神經元在放電頻率、峰間期（ISI）等方面的變化，描述并分析此變化過程中小鼠海馬區神經電信號的特征差異。

2 材料與方法

2.1 材料

（1）實驗動物：16只ICR小鼠，體質量25～35 g，清潔級，購自南京市江寧區青龍山動物養殖場。

（2）實驗儀器與試劑：微電極；多通道神經信號采集系統（Cerebus，Blackrock公司），包括前置放大器（headstage）、Front-end放大器模塊、信號處理器及操作計算機，計算機與信號處理器間通過網絡相互通訊；腦立體定位儀（ZH-藍星B，淮北正華生物儀器設備有限公司）；5%水合氯醛。

2.2 實驗方法

（1）動物手術：利用ICR小鼠16只，隨機分成2組（n＝8）：急性飲酒組（P組）和生理鹽水組（C組）。將小鼠稱重，按45 mg／（100 g體重）計量腹腔注射復合麻醉劑，待完全麻醉后臥姿固定四肢及頭部在小鼠腦立體定位儀上，切開頭部皮膚，除去部分顱骨。將記錄電極經大腦皮層插入海馬CA1區，定位是前囟后1.8 mm，旁開1.5 mm，由大腦皮層表面向下約2 mm，放好參考電極和接地電極。上下微調記錄電極的位置，直到記錄到明顯的鋒電位信號為止。

（2）小鼠海馬區鋒電位（Spike）的采集記錄：設置信號采集處理系統Cerebus的各項參數[12]：以采樣率為30 Khz進行原始數據采集，調整采樣率為2 Khz得到LFPs；再選擇250～7 500 Hz帶通濾波，設定閾值為-5.00 RMS增益，選取信噪比超過1.5的鋒電位認定為每個細胞外神經點位，即為鋒電位Spikes。邊觀察采樣窗口掃描波形，邊適當調整記錄電極尖端深度，直至采樣記錄窗口出現的放電波形大于閾電位、利用采樣記錄軟件可選擇的色標，將多種記錄波形以不同顏色加以區分，同時在記錄窗口的各子窗口將不同的疊加波形分別顯示。實時觀察采樣電信號的信噪比（signal noise ratio，SNR）大小，當SNR值大于1.5且較穩定后采集記錄神經放電信號。以時間長度每300 s為一采集記錄單位，按照系統設定的存儲文件格式存檔以作進一步離線分析。采用趾的刺激反射（趾蹼反射）和角膜反射判斷大鼠麻醉及復蘇狀態，然后分別在小鼠復蘇后急性飲酒前以及急性飲酒后 0、20、40、60、80 min記錄小鼠海馬區神經電信號，每次實驗記錄5 min，其中急性飲酒量為1.5 g／（kg體重）。

（3）神經電信號分析：采用信號分析處理軟件wave clus和NeuroExplorer分析存儲的放電信號文件，比較急性飲酒前和急性飲酒后 0、20、40、60、80 min小鼠海馬CA1區神經元鋒電位在放電頻率、ISI等方面的差異。

3 統計學處理

實驗數據用均數±標準差表示，采用SPSS 11.5統計軟件進行常規統計，比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

4 結果

圖1 （a）電極在海馬區中的植入位置（b）電極插入照片Fig 1 （a）position of the electrodes implanted in the hippocam pus（b）picture of inserted electrode

4.1 電極擺放的解剖學位置

海馬CA1區定位是前囟后1.8 mm，旁開1.5 mm，由大腦皮層表面向下約2 mm。圖1（a）是電極在海馬區中的植入位置，圖1（b）是實驗中電極插入小鼠海馬區照片。

4.2 8通道的原始信號

圖2是記錄到的海馬區神經元鋒電位發放光柵圖，圖中每條短線代表一次鋒電位發放。

圖2 海馬區神經元鋒電位發放原始信號光柵圖A、B、C、D、E、F分別代表飲酒前、飲酒后0、20、40、60、80 min。Fig 2 Raster p lots of spikes distributed by hippocam pal neuronsA，B，C，D，E，F，respectively，on behalf of the time before drinking，0，20，40，60，80min after drinking

4.3 小鼠蘇醒時及急性飲酒后神經元自發放電信號特征差異比較

運用神經信號分析軟件Neuro Explorer分析發現，P組與C組比較，在每個時間段，P組平均放電率小于C組平均放電率（P組平均放電率依次為：1±0.32、0.48±0.14、0.13±0.09、0.54±0.17、0.82±0.26、0.93±0.29，C組平均放電率依次為：1±0.3、0.81±0.21、0.86±0.18、0.91±0.15、0.94±0.23、0.96±0.21）；P組小鼠在急性酒精注射后，海馬CA1區神經元自發放電減小，20 min左右放電率最低，并且急性飲酒后平均放電率遠小于急性飲酒前（清醒狀態）；并且隨著時間的推移，神經元在單位時間內放電在逐漸增加（復蘇狀態），1 h后慢慢恢復，即小鼠急性飲酒前后神經元放電頻率存在明顯差異（見圖3），差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖3 鋒電位平均放電率曲線圖Fig 3 M ean firing rate of spikes

急性飲酒前，神經元電信號以串的形式呈有節律的陣發性發放（圖4A，圖4為一只老鼠的ISI變化圖）。隨著飲酒后時間的增加，小鼠海馬CA1區自發放電有越來越多的脈沖出現在串脈沖之外，漸呈彌散性發放（圖4B、4C），全時長的自發放電頻率均小于飲酒前狀態。急性飲酒前的小鼠ISI值較為集中（清醒狀態）（圖4A），急性飲酒后的小鼠ISI值較為分散（圖4B、4C、4D），并隨著時間的推移，ISI值逐漸變得集中（復蘇狀態，見圖4E、4F）。

圖4 急性飲酒前后ISI變化圖A、B、C、D、E、F分別代表飲酒前、飲酒后0、20、40、60、80 minFig 4 Changes of ISI before and after acute alcohol consumptionA，B，C，D，E，F were on behalf of the time before drinking and 0，20，40，60，80 min after drinking

5 討論

有關酒精導致腦損傷的研究很多都集中在慢性酗酒引起酒精中毒，比如酒精濫用和酒精依賴等。而有關酒精導致腦損傷在急性飲酒方面的研究大都集中在生理層面[13]，比如進行離體腦片和急性飲酒對鼠腦損傷標志物的影響等。本研究著力于從電生理角度在體測量小鼠腦電信號，研究急性飲酒前后小鼠海馬CA1區神經元放電特征差異。

本研究的前期工作已穩定地采集記錄到小鼠急性飲酒前后、海馬CA1區神經元的放電信號，并對測得的信號進行了放電頻率等指標的分析。為了探索急性飲酒前后小鼠海馬區神經元自發放電特征是否存在差異，本實驗采用單次大量酒精腹腔注射作為急性飲酒的動物模型，并進行實驗數據的分析。選用該動物模型除了操作簡單易行以外，單次大量酒精腹腔注射更與現實人們偶爾飲酒過量這種情況相似[14]。大多數人認為偶爾急性飲酒可能對身體一般機能有些影響，但不會對記憶造成大的影響。這正是本研究要強調的即使是一次急性飲酒也會對大腦記憶能力產生損害[15]。

本研究表明，急性腹腔注射酒精后的小鼠海馬CA1區神經元自發放電減少，20 min左右放電率最低，遠小于急性飲酒前；并且隨著時間的推移，神經元放電在逐漸增加，一個小時之后慢慢恢復。急性飲酒后，神經元電信號以串的形式呈有節律的陣發性發放；隨著飲酒后時間的增加，小鼠海馬CA1區自發放電有越來越多的脈沖出現在串脈沖之外，漸呈彌散性發放，全時長的自發放電頻率均小于飲酒前狀態。此外，急性飲酒前的小鼠ISI值較為集中，急性飲酒后的小鼠ISI值較為分散，并隨著時間的推移，ISI值逐漸變得集中。這一結果與文獻報道進行的行為實驗結果一致[16]。

從生理機制來看，酒精可以快速通過血液屏障進入腦組織中進行氧化和非氧化代謝因為大腦有很高的氧代謝率，其對于由酒精引起的氧化應激損傷更為敏感。根據對小鼠急性飲酒對小鼠腦損傷生物標志物的影響，一次性大量飲酒就會誘發腦組織的氧化應激性損傷[8，17-18]，這與本研究實驗結果一致。本研究利用神經信號分析軟件對電信號進行分析發現急性飲酒前后小鼠海馬區神經元自發放電頻率方面存在差異，急性飲酒對小鼠記憶功能有著抑制作用，為急性飲酒所致的記憶力損傷的預防和治療提供了有意義的神經電生理依據。

6 結論

本研究發現，與對照組相比，急性飲酒組小鼠海馬區放電率明顯變小；急性飲酒后小鼠海馬區神經元自發放電與急性飲酒前相比，在放電頻率、ISI等神經信號的特征方面存在明顯差異。由此可見，急性飲酒可抑制小鼠海馬區神經元放電，抑制小鼠記憶功能。