同型半胱氨酸電極的研制及其測定性能研究

2016-11-09 08:32:12江書慶薄惠劉寬浩李錕

生物醫(yī)學(xué)工程研究 2016年3期

江書慶，薄惠，劉寬浩，李錕

（黃河科技學(xué)院醫(yī)學(xué)院，河南鄭州450063）

1 引言

同型半胱氨酸（HCY），或稱為高半胱氨酸，是氨基酸半胱氨酸的異種。同型半胱氨酸在體內(nèi)由蛋氨酸脫甲基生成，一旦生成，同型半胱氨酸在酶的催化下或者不可逆地通過脫硫作用異化為半胱氨酸，或者重新甲基化生成蛋氨酸。人體每天合成的同型半胱氨酸為15～20 mmol，但其中的大多數(shù)轉(zhuǎn)化為半胱氨酸，或者在胱硫醚β合成酶的作用下轉(zhuǎn)化為蛋氨酸。血漿中同型半胱氨酸的正常濃度在5～15 μmol／L，15～30μmol／L為稍高于正常值，30～100 μmol／L為中等高值，超過 100μmol／L即為嚴(yán)重超標(biāo)。

血液中同型半胱氨酸濃度的升高容易引起下列幾種疾病：（1）與身體機能的失調(diào)有關(guān)疾病，如神經(jīng)管缺陷、妊娠綜合癥、精神錯亂、老年精神問題、癌癥、高胰島素癥[1-2]。（2）心血管疾病，同型半胱氨酸量的升高與動脈粥樣硬化血管和動脈粥樣血栓化血栓有直接的關(guān)系[3-6]。因此，目前在臨床上逐漸加強了對人體血液中同型半胱氨酸的測定。

現(xiàn)階段同型半胱氨酸的測定方法主要有氣相色譜 -質(zhì)譜聯(lián)用法[7]、液相色譜 -質(zhì)譜聯(lián)用法[8]、高效液相色譜法[9]、毛細(xì)管電泳法和免疫分析法[10-11]。在這些方法中，色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)能夠提高其準(zhǔn)確度和靈敏度，但所需要的設(shè)備非常昂貴。免疫分析是近幾年發(fā)展最快的方法，但開發(fā)周期長，成本非常高。這些方法作為實驗室檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法具有一定的應(yīng)用價值，但檢測成本太高。如果能在基層醫(yī)院、社區(qū)門診開展同型半胱氨酸的測定，使同型半胱氨酸的測定成為監(jiān)控老年人身體狀況的一個指標(biāo)，對預(yù)防心腦血管疾病具有十分重要的社會意義。所以在此基礎(chǔ)上，我們研究開發(fā)了同型半胱氨酸分子印跡電極，能夠快速、準(zhǔn)確地檢測同型半胱氨酸。

2 儀器與試藥

飽和甘汞電極、211型玻璃電極（上海偉業(yè)儀器廠），pHS-3C型精密酸度計（上海理達(dá)有限公司）；TU-1810型紫外可見分光光度計（北京普析儀器公司），電子天平（上海良平儀器儀表有限公司）。同型半胱氨酸、α-甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）、偶氮二異丁腈（AIBN）購于阿拉丁試劑有限公司，二硫代蘇糖醇（DDT）購于德國Ruibio，其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

3 方法與結(jié)果

3.1 Hcy分子印跡模板的制備

精密稱取0.1352 g（1 mmol）Hcy溶于10 ml甲醇-乙酸（1：1）混合液中，再加入 0.3444 g（4 mmol）α-甲基丙烯酸功能單體，在20 ml試管中超聲1 h，使Hcy與功能單體充分作用，再加入7.9288 g（40 mmol）EDMA交聯(lián)劑和20 mg引發(fā)劑 AIBN，然后向該溶液中通氮氣5 min，真空下密封試管，并將其放入60℃水浴中加熱24 h，得白色塊狀聚合物。經(jīng)研缽研磨，過200目的篩，用甲醇-乙酸（1∶1，V／V）混合液洗至濾液用紫外分光光度計檢測不出Hcy為止，繼續(xù)用 NaOH洗去乙酸，再用水洗去NaOH，最后用無水乙醇再洗3遍，放入真空干燥器中干燥至恒重，即得同型半胱氨酸分子印跡模板。

3.2 同型半胱氨酸分子印跡-玻璃涂層離子選擇性電極的制備[12-13]

將玻璃電極在蒸餾水中浸泡48 h，用二次蒸餾水沖洗干凈，再用無水乙醇沖洗吹干待用。

稱取聚氯乙烯（PVC）粉0.20 g，用10 ml四氫呋喃溶解，再加電活性物質(zhì)30 mg，鄰苯二甲酸二丁酯0.20 ml，超聲處理，使其分散均勻。將上述pH玻璃電極浸入到該液體中，緩慢取出，晾干后再浸入，如此反復(fù)多次，使玻璃電極表面均勻涂敷一層PVC膜，此即同型半胱氨酸分子印跡-玻璃涂層電極。

3.3 電極電位測量方法

先將電極在10-3mol／L的同型半胱氨酸溶液中浸泡活化2 h，用水沖洗后與飽和甘汞電極組成測量電池，連接離子活度計，測量水的空白電位值，待其穩(wěn)定后即可測定電動勢，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定同型半胱氨酸的含量。

4 討論

4.1 電活性物質(zhì)的選擇

比較空白印跡模板、未洗滌的聚合物和同型半胱氨酸分子印跡模板作為電活性物質(zhì)進行測試，結(jié)果表明，空白印跡模板對同型半胱氨酸無明顯的響應(yīng)，未洗滌的聚合物作為電活性物質(zhì)其響應(yīng)性能弱于同型半胱氨酸分子印跡模板作為電活性物質(zhì)的電極，所以，本研究選擇同型半胱氨酸分子印跡模板為電活性物質(zhì)制備的電極進行研究。

4.2 pH值的選擇

用HCl和NaOH溶液調(diào)節(jié)1.0×10-4mol·L-1的同型半胱氨酸溶液的pH值，測量溶液在不同pH值下的電極電位E，作E～pH曲線見圖1。由圖1可知，當(dāng)同型半胱氨酸溶液pH值為2.2～3.2，電極電位變化較小。為了便于控制溶液的pH值，選擇pH2.7作為測定溶液的pH值。

圖1 pH值的影響Fig 1 Effect of pH on the electrode response

4.3 電極Nernst響應(yīng)曲線

依次測量同型半胱氨酸的濃度在1×10-2mol／L～1×10-6mol／L標(biāo)準(zhǔn)溶液的電位值E，以電位值E對同型半胱氨酸的溶液的pC做圖，見圖2。可知，同型半胱氨酸的濃度在5×10-3mol／L～5×10-5mol／L，E～pC具有良好的線性關(guān)系，該曲線的線性方程為：E＝49.0 pC-352.1，r＝0.9992。

圖2 電極響應(yīng)曲線Fig 2 Response curve

4.4 電極的選擇性

采用等濃度溶液法測定一些常見氨基酸的選擇性系數(shù)，結(jié)果見表1。由表1可知，常見的氨基酸對測定無顯著性干擾，特別是L-半胱氨酸。

表1 常見氨基酸的選擇性系數(shù)Table 1 The selectivity coefficient of common amino acids

4.5 電極使用壽命

檢測所制備的電極在3個月內(nèi)的Nernst響應(yīng)性能，結(jié)果表明，試驗期間電極的響應(yīng)性能無顯著性變化。則電極使用壽命大于3個月。

4.6 回收率實驗

取在鼠全血 1 ml，15μl EDTA-Na2（7.5%）抗凝，20℃離心（2500 r／min）20 min，分離血漿。取200μl血漿，再加入0.3 mol／LHClO4工作液800μl沉淀蛋白，加入1 ml EDTA-Na2（7.5%）配合金屬離子10 min后，分別加入2.00、5.00、10.00 ml HCY標(biāo)準(zhǔn)溶液，再加入加50μl新鮮配制0.05 mol／L DTT溶液，室溫放置還原20min，定量轉(zhuǎn)移至25ml容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。按方法2.2.3進行回收率實驗，平均回收率為101.3%，RSD為2.71%（表2），該方法的準(zhǔn)確度和精密度均較為滿意。