槲皮素對H2O2誘導人RPE細胞氧化應激損傷的保護作用

張佳君，厲新新，陳寶石，劉麗娟

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槲皮素對H2O2誘導人RPE細胞氧化應激損傷的保護作用

張佳君，厲新新，陳寶石，劉麗娟

the Second Ward of Ophthalmology, First Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150001, Heilongjiang Province, China

?METHODS: RPE cells were subculture, and they were divided into negative control group: cultured with normal culture medium; oxidative injury group: 100 μmol/L H2O2treated for 12h; quercetin low dose group: 100 μmol/L quercetin incubated for 24h then treated with 100 μmol/L H2O2for 12h; and quercetin high dose group: 100 μmol/L quercetin incubated for 24h then treated with 100 μmol/L H2O2for 12h. Cell viability were tested by MTT colorimetric detection, apoptosis rate was detected by flow cytometry, apoptotic cell morphology was observed by Hochest33258 staining, expression of catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GSH-Px) were tested by colorimetric detection.

?RESULTS: Quercetin inhibited H2O2-induced cell viability decreased in RPE cells, after treated with different concentrations of quercetin, RPE cells activity increased to (79.67±4.98)% and (83.00±3.60)%, which had statistical significance difference compared with oxidative damage group (48.93±3.39)% (P<0.05). After treated with different concentrations of quercetin, the apoptosis rate of RPE cells decreased to (23.23±3.29)% and (16.23±1.94)%, respectively, which had statistical significance difference compared with oxidative damage group (38.03±4.76)% (P<0.05). In addition, quercetin also increased the expression of CAT、SOD、GSH-Px in RPE cells, which had statistical significance difference compared with oxidative damage group.

?CONCLUSION:Quercetin effectively inhibited H2O2-induced RPE cells damage by improving cell antioxidant enzyme activity, which provide reliable experimental basis for the treatment of injuries in RPE cells.

目的:探討槲皮素對H2O2誘導的人視網膜色素上皮細胞(retina pigment epithelium，RPE)氧化應激損傷的保護作用及可能機制。

方法：RPE細胞傳代培養，分為陰性對照組：以正常培養液培養；氧化損傷組：100μmol/L的H2O2作用12h；槲皮素低濃度組：100μmol/L槲皮素孵育24h后，加入H2O2作用12h；槲皮素高濃度組：500μmol/L槲皮素孵育24h后，加入H2O2作用12h。MTT比色法檢測細胞活力，流式細胞儀檢測細胞凋亡率，Hochest33258染色觀察凋亡細胞形態，比色法檢測細胞中過氧化氫酶(catalase，CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)活性。

結果：槲皮素能明顯抑制H2O2誘導的RPE細胞活力的下降，用不同濃度槲皮素處理后，RPE細胞活性分別提高到79.67%±4.98%和83.00%±3.60%，與氧化損傷組(48.93%±3.39%)比較，差異具有統計學意義(P<0.05)；經不同濃度槲皮素處理后，RPE細胞凋亡率分別下降至23.23%±3.29%和16.23%±1.94%，與氧化損傷組(38.03%±4.76%)比較，差異具有統計學意義(P<0.05)；此外，槲皮素還能增加細胞中CAT、SOD、GSH-Px活性，與氧化損傷組比較，差異均具有統計學意義(P<0.05)。

結論：槲皮素通過改善細胞中抗氧化酶活性有效抑制了H2O2對RPE細胞的損傷，從而為其用于治療RPE細胞損傷提供可靠的實驗依據。

槲皮素；視網膜色素上皮；過氧化氫酶；超氧化物歧化酶；谷胱甘肽過氧化物酶

引用：張佳君，厲新新，陳寶石，等.槲皮素對H2O2誘導人RPE細胞氧化應激損傷的保護作用.國際眼科雜志2016;16(11):2010-2013

0　引言

糖尿病患者因糖代謝障礙導致全身各組織器官的微血管發生病變，其中糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是最嚴重的并發癥之一[1]。研究表明，氧化應激與DR的發生密切相關。視網膜色素上皮層位于視網膜神經上皮層與脈絡膜毛細血管層之間，由單層排列的RPE細胞構成，當收到外界各種因素刺激時，容易導致生理功能的破壞，是DR最早受損傷的靶組織[2]。本實驗模擬DR發生機制，體外建立RPE細胞氧化損傷模型，對比分析不同濃度的槲皮素干預RPE細胞后細胞活力以及相關因子表達的變化，并進一步探討其細胞保護機制，為其用于防治DR提供新的實驗依據。

1　材料和方法

1.1材料槲皮素(美國Sigma公司，批號 PHR1488，分子量 302.24 )，人RPE細胞株(美國ATCC，批號CRL-4000)，30% H2O2(天津基準化學試劑有限公司，批號20131016)，DMEM培養基(Sigma公司，批號D0819)，胎牛血清(Sigma公司，批號12107C)，MTT試劑盒(Sigma公司，批號M2128)，Annexin V FITC/PI(美國BD公司，批號556570)，Hoechst33258試劑盒(碧云天公司，批號C1011)，CAT、SOD、GSH-Px試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司，批號S0101，S0051，S0053)。

1.2方法

1.2.1細胞培養RPE細胞培養在100μg/mL鏈霉素及100U/mL青霉素的DMEM培養基中，內含15%胎牛血清，培養箱溫度為37℃。

1.2.2細胞分組共分4組：(1)陰性對照組：以正常培養液培養;(2)氧化損傷組：100μmol/L H2O2作用12h；(3)槲皮素低濃度組：100μmol/L槲皮素孵育24h后，加入H2O2作用12h；(4)槲皮素高濃度組：500μmol/L槲皮素孵育24h后，加入H2O2作用12h。

1.2.3 MTT檢測細胞活力細胞接種于96孔板(細胞密度5×104/L，每孔120μL培養24h使細胞融合約80%～90%，將原培養液吸出，向各孔細胞中加入20μL終濃度為5g/L的MTT無血清培養液，培養4h后棄去培養液，加入150μL的DMSO溶液，置搖床搖晃10min后用酶標儀測定492nm的光密度值。

1.2.4流式細胞技術檢測細胞凋亡各組RPE細胞六孔板內培養，經過相應處理后，用1g/L胰酶消化后制備細胞懸液。1000r/min離心后收集細胞，用Annexin V-FITC試劑盒中緩沖液懸浮細胞，調節細胞濃度為5×104/L，取上述細胞分別按試劑盒說明，加入Annexin和PI，混勻后孵育20min，于1h內用流式細胞儀檢測細胞凋亡，以上操作均在暗室內避光進行。檢測結果圖共分4個象限，第四象限代表凋亡早期的細胞數量，細胞凋亡率=第四象限凋亡細胞/總細胞數×100%。

1.2.5 Hoechst33258染色觀察凋亡細胞形態各組RPE細胞六孔板內培養，經過相應處理后，PBS沖洗3次，每次2min，用固定液固定20min后用PBS再沖洗2次，加入染色液暗室內固定20min，吸掉染色液后于倒置顯微鏡下觀察并記錄細胞形態(×400)。每組5張不同的圖片上各隨機選取5個視野計數，凋亡細胞細胞核熒光較強，呈致密濃染，細胞凋亡率=凋亡細胞/總細胞數×100%。

表1槲皮素對RPE細胞活性的影響

，n=3)

注：aP<0.05vs陰性對照組；cP<0.05vs氧化損傷組。

1.2.6 SOD和CAT與GSH-Px活性的檢測收集細胞并用1g/L胰酶消化，1200r/min離心10min，收集細胞并用PBS沖洗2次，每份樣品加30μL細胞裂解液，冰上孵育20min，10000r/min離心10min，然后按試劑盒操作步驟測定細胞裂解液中CAT、SOD、GSH-Px活性。

2　結果

2.1槲皮素對H2O2致RPE細胞氧化損傷的影響槲皮素能明顯抑制H2O2誘導的RPE細胞活力的下降，氧化損傷組RPE細胞經H2O2處理后，細胞活性明顯下降(48.93%±3.39%)，用不同濃度槲皮素處理后，RPE細胞活性分別提高到79.67%±4.98%和83.00%±3.60%，與氧化損傷組比較，差異具有統計學意義(P<0.05，表1)。

2.2槲皮素對氧化損傷致RPE細胞凋亡的抑制作用氧化損傷組RPE細胞凋亡率(38.03%±4.76%)顯著高于陰性對照組(2.57%±0.76%)，兩者比較差異有統計學意義(P<0.01)。結果表明，H2O2可以導致RPE細胞凋亡的發生，經不同濃度槲皮素處理后，其凋亡率分別下降至23.23%±3.29%和16.23%±1.94%，與氧化損傷組比較差異具有統計學意義(P<0.05，圖1)。

2.3槲皮素對H2O2誘導RPE細胞凋亡的影響Hoechst33258核染色法顯示，陰性對照組(3.00%±1.00%)未見明顯凋亡染色的細胞核，氧化損傷組(41.67%±4.33%)凋亡細胞明顯增多，細胞核熒光較強，呈致密濃染，給予不同濃度的槲皮素作用后凋亡細胞減少(36.67%±4.22%，18.67%±3.45%)，細胞核形態改善，熒光強度逐漸減弱(圖2)。與流式細胞計數檢測結果一致。

2.4槲皮素對RPE細胞內CAT和SOD與GSH-Px活性的影響從表2中可以觀察到，氧化損傷組RPE細胞中CAT、SOD、GSH-Px活性明顯降低，與陰性對照組比較差異具有統計學意義(P<0.05)。給予不同濃度槲皮素處理后，CAT、SOD、GSH-Px表達量升高，槲皮素高劑量組與氧化損傷組比較，差異具有統計學意義(P<0.05)。

3　討論

高血糖導致的氧化應激增強被認為是糖尿病并發視網膜病變的重要因素，大量證據表明，氧化應激損傷在視網膜疾病的發生發展過程中起著重要的作用[3]。過量的活性氧可直接發揮細胞毒性作用損傷細胞。H2O2常作為建立體外氧化應激損傷模型的工具，分解后產生的羥基自由基可導致細胞氧化損傷，RPE細胞對氧化應激較為敏感，我們利用100μmol/L H2O2建立細胞氧化損傷模型，觀察槲皮素對該細胞的保護作用。

圖1流式細胞計數檢測槲皮素對H2O2誘導RPE細胞凋亡的抑制作用A：陰性對照組；B：氧化損傷組；C：槲皮素低濃度組；D：槲皮素高濃度組；E：槲皮素對H2O2誘導RPE細胞凋亡的抑制作用的柱形圖(aP<0.05，bP<0.01vs氧化損傷組)。

圖2槲皮素對氧化損傷致RPE細胞凋亡的抑制作用A：陰性對照組；B：氧化損傷組；C：槲皮素低濃度組；D：槲皮素高濃度組； E：槲皮素對H2O2誘導RPE細胞凋亡的抑制作用的柱形圖(aP<0.05，bP<0.01vs氧化損傷組)。

表2槲皮素對RPE細胞內CAT和SOD與GSH-PX含量的變化

組別CAT(U/mg)SOD(U/mL)GSH-Px(U/mL)對照組46.66±3.0588.74±3.76132.03±3.03氧化損傷組24.57±4.38b51.89±4.66b79.46±3.54b槲皮素低劑量組26.89±3.2959.06±3.4483.03±4.37槲皮素高劑量組39.49±3.83a70.75±3.04a116.57±3.80a

注：aP<0.05vs氧化損傷組；bP<0.01vs對照組。

抗氧化劑因可延緩DR的發展而在DR的防治中得到重視。槲皮素是一種廣泛存在于中草藥和蔬果中的天然黃酮類化合物，具有多種生物活性，其中包括清除自由基，下調由活性氧介導的下游信號通路[4-5]。國內外還少見槲皮素在眼科中的應用研究，為此該課題利用槲皮素保護RPE細胞緩解由H2O2所致的氧化損傷，初步探討了槲皮素保護RPE細胞免受氧化損傷的效果與機制。

細胞活力檢測結果顯示，H2O2處理的細胞活力明顯降低，槲皮素能夠抑制H2O2誘導的細胞損傷，而且這種藥物對細胞的保護作用呈劑量依賴性；流式細胞術及Hoechst33258核染色法測定凋亡結果同樣表明，H2O2作用下RPE早期凋亡率明顯增加，槲皮素有效抑制了H2O2誘導的凋亡反應的發生。

生理狀態下，機體抗自由基損傷的酶如SOD、GSH-Px能有效地清除活性氧和自由基，使自由基的產生和清除處于平衡；超氧化物歧化酶(SOD)能夠提供氫原子配體而使其還原生成H2O2，進而被谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和過氧化氫酶(CAT)催化還原生成對人體無害的H2O和O2，進一步降低過氧化損傷[6-7]。用槲皮素干預后RPE細胞中CAT、SOD、GSH-Px活性較氧化損傷組顯著升高，提示槲皮素可能通過提高細胞內CAT、SOD、GSH-Px活性發揮其較強的抗氧化作用。

綜上所述，槲皮素對H2O2誘導RPE細胞氧化應激損傷具有劑量相關性的保護作用，其作用機制可能與槲皮素能夠有效改善抗氧化酶活性、增強自由基清除能力從而抑制氧化應激損傷有關，從而為其用于治療RPE細胞損傷提供可靠的實驗依據。

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3陳放，徐珊，呂偉紅.糖尿病大鼠視網膜氧化應激損傷及葛根素的干預作用.眼科新進展 2012；32(1):15-19

4劉紅亮，胡磊，王靖凱，等.槲皮素對H2O2損傷PC12細胞的保護效果與機制.中國藥理學通報 2014；30(3):373-377

5劉鵑，康剛勁.槲皮素對晶狀體保護作用的研究進展.國際眼科雜志 2015；15(1):49-51

6 Pehar M, Beeson G, Beeson CC,etal. Mitochondria-targeted catalase reverts the neurotoxicity of hSOD1G93A astrocytes without extending the survival of ALS-linked mutant hSOD1 mice.PLoSOne2014;9(7):e103438

7 Yuhai GU, Zhen Z. Significance of the changes occurring in the levels of interleukins, SOD and MDA in rat pulmonary tissue following exposure to different altitudes and exposure times.ExpTherMed2015;10(3):915-920

Effects of quercetin on H2O2-induced oxidative damage in human retina pigment epithelium cells

Jia-Jun Zhang, Xin-Xin Li, Bao-Shi Chen, Li-Juan Liu

Li-Juan Liu. the Second Ward of Ophthalmology, First Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150001, Heilongjiang Province, China. 3051136639@qq.com

2016-07-04Accepted：2016-09-28

?AIM: To discuss the protective effects and possible mechanisms of quercetin in oxidative damage of human retina pigment epithelium (RPE) cells induced by H2O2.

quercetin; human retina pigment epithelium; catalase; superoxide dismutase; glutathione

(150001)中國黑龍江省哈爾濱市，哈爾濱醫科大學附屬第一醫院眼科二病房

張佳君，女，護師，研究方向： 眼底病。

劉麗娟，副主任護師，研究方向：眼底病.3051136639@qq.com

2016-07-04

2016-09-28

Zhang JJ, Li XX, Chen BS,etal. Effects of quercetin on H2O2-induced oxidative damage in human retina pigment epithelium cells.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(11):2010-2013

10.3980/j.issn.1672-5123.2016.11.07

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