銀杏葉提取物對局灶性腦缺血大鼠血管內皮因子表達的影響

朱美娥，龔道愷

(華中科技大學同濟醫學院附屬荊州醫院，湖北 荊州 434000)

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銀杏葉提取物對局灶性腦缺血大鼠血管內皮因子表達的影響

朱美娥，龔道愷

(華中科技大學同濟醫學院附屬荊州醫院，湖北 荊州 434000)

目的探討銀杏葉提取物對大鼠局灶性腦缺血后神經行為及血管內皮因子(VEGF)表達的影響。方法采用線栓法制備局灶性腦缺血大鼠模型，將24只造模成功的SD大鼠隨機分為模型組及銀杏葉提取物低、中、高劑量組，每組6只，另選取正常大鼠6只作為假手術組。銀杏葉提取物低、中、高劑量組分別給予銀杏葉提取物注射液0.9，1.8，2.7 mL/100 g灌胃，假手術組及模型組給予1.8 mL/100 g生理鹽水灌胃，均1次/d，連續14 d。通過平衡木實驗評價大鼠的神經行為學改變，HE染色觀察大鼠腦組織形態學變化，采用逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)和免疫組織化學法檢測大鼠腦內VEGF mRNA以及蛋白的表達情況。結果灌胃7 d和14 d后，銀杏葉提取物低、中、高劑量組的平橫木實驗測試評分均明顯高于模型組(P均<0.05)，且銀杏葉提取物中劑量組明顯高于低劑量組和高劑量組(P均<0.05)；HE染色顯示銀杏葉提取物能改變腦組織缺血區的組織形態；模型組VEGF mRNA及蛋白表達量均明顯高于假手術組(P均<0.05)，銀杏葉提取物低、中、高劑量組VEGF mRNA及蛋白表達量均明顯高于模型組(P均<0.05)，且銀杏葉提取物中劑量組VEGF mRNA及蛋白表達量均明顯高于低劑量組和高劑量組(P均<0.05)。結論銀杏葉提取物能夠改善局灶性腦缺血大鼠的神經功能，可能與上調大鼠腦組織中VEGF mRNA及蛋白的表達有關；銀杏葉提取物對缺血性腦損傷的改善程度與給藥劑量有關。

銀杏葉提取物；局灶性腦缺血；血管內皮生長因子

腦血管疾病是臨床常見病、多發病，其發病率、病死率及致殘率有逐年上升的趨勢，其中缺血性腦血管病占43%～65%[1]。腦缺血后，導致腦組織缺氧，缺血中心區細胞迅速死亡，半暗區神經細胞處于低氧、低灌注狀態，及時恢復該區域血流供應有望改善患者的神經功能。而半暗區血流的恢復有賴于側支循環的建立，血管再生是決定這些細胞存活的關鍵因素，與缺血后腦卒中患者的預后關系密切。在血管再生過程中，有眾多因子參與調節，其中血管內皮生長因子(vasular endothelial growth factor,VEGF)是血管內皮細胞的特異性多功能因子，能夠抑制內皮細胞的凋亡[2]，參與腦缺血后的病理修復過程，是已知作用最強和特異性最高的促血管生長因子[3]。現代藥理學研究表明，銀杏葉提取物能夠清除自由基，拮抗血小板活化因子，而且具有抗腦細胞凋亡、促進腦內神經因子表達等作用，對心腦血管疾病具有明顯療效[4]。本研究以線栓法制備大鼠局灶性腦缺血模型，觀察銀杏葉提取物對腦缺血大鼠神經行為學、腦組織形態學及腦內 VEGF mRNA和蛋白表達的影響，探討銀杏葉提取物發揮腦保護的作用機制。

1　實驗資料

1.1實驗動物健康6～7周齡雄性SD大鼠50只，SPF級，體質量(260±20)g，購買自北京中醫藥大學實驗動物中心。

1.2藥品、試劑及主要儀器銀杏葉提取物注射液(含銀杏葉提取物17.5 mg/5 mL，北京悅康藥業集團有限公司)；鼠抗人VEGF抗體(北京天根生化科技有限公司)；蘇木素(Sigma公司，美國)；注射用青霉素鈉(山東魯抗醫藥股份有限公司)；10%水合氯醛；4%多聚甲醛；伊紅染色液；0.9%氯化鈉注射液；TP600 PCR擴增儀(TaKaRa，日本)；自動切片機(LEICARM2145，德國);全自動脫水機(LEICARASP300，德國)；CX41光學顯微鏡，(OLYMPUS，日本)。

1.3實驗方法

1.3.1模型的建立隨機取44只大鼠，參考Longa等[5]和朱繼等[6]報道的線栓法建立局灶腦缺血大鼠模型：大鼠稱質量后，按10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉；頸部正中切口，在頸總動脈深面穿一細線，鈍性分離頸內、外動脈；提起該側頸總動脈(CCA)，用眼科剪于CCA近分叉處剪一約0.2 mm的V型切口，將一直徑約0.2 mm的尼龍線穿入頸內動脈(ICA)；然后將切口的遠心端及動脈內的絲線牢固結扎，造成大腦中動脈栓塞模型。以上過程均在恒定室溫(24～25 ℃)情況下進行，以利于評價腦缺血程度。剩余6只大鼠作為假手術組，除插線1 cm外，其余步驟同造模組。

1.3.2實驗動物分組及給藥將造模成功的24只大鼠隨機分為模型組和銀杏葉提取物低、中、高劑量組各6只。手術造模成功后24 h，銀杏葉提取物低、中、高劑量組分別給予銀杏葉提取物注射液0.9，1.8，2.7 mL/100 g灌胃，假手術組及模型組給予1.8 mL/100 g生理鹽水灌胃，均1次/d，連續14 d,末次灌胃24 h后取標本。

1.3.3神經行為學評分分別在術后24 h及灌胃7 d、14 d，參考Feeney等[7]大鼠平衡木實驗(Beam walking test,BWT)評價大鼠精細運動功能情況。根據大鼠是否能夠順利爬過橫木及癱瘓側肢體起作用的情況評定，BWT評分為1～7分。

1.3.4腦組織病理學觀察灌胃14 d后，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.3 mL/100 g)，斷頭處死，冰盤上迅速完整剝取腦組織，浸入4%多聚甲醛固定液中，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，4μm厚冠狀連續切片進行HE染色，光鏡下觀察腦組織形態學改變。

1.3.5VEGF mRNA表達檢測采用RT-PCR法檢測。引物合成：引物設計參考Gene-bank數據庫， VEGF基因：上游5’-GTAACCTAGGCCTGTGAACCGTGG-3’，下游5’-GCATCCTTGCATGCGCTTGCATGG-3’,DNA擴增全長為341 bp；內參引物序列β-actin：上游5’- CAGGATGCAGAAGGAGATTA-3’，下游5’-ATCCACATCTGCTG GAAG-3’，DNA擴增全長為265 bp。采用Trizol一步法提取腦組織總RNA。取10 μL PCR反應產物，在2.0%瓊脂糖凝膠上電泳(50 V，45 min)，置于紫外透射儀下照相。應用Image J軟件對RT-PCR電泳結果進行灰度分析，按照以下公式計算VEGF mRNA的相對表達量：產物含量=目的基因的光密度值/β-actin的光密度值×100%。

1.3.6VEGF蛋白表達檢測對組織切片進行常規脫蠟和抗原修復，按試劑盒說明書進行免疫組化染色，采用ABC法。以PBS代替一抗作陰性對照，已知陽性片作陽性對照，VEGF主要在細胞質表達。采用Image Pro Plus醫學圖像分析系統進行圖像分析，測出陽性反應細胞的積分光密度(IOD)。

2　結　　果

2.1各組大鼠神經行為學評分灌胃7 d和14 d后，模型組BWT評分均明顯低于假手術組(P均<0.05)，銀杏葉提取物低、中、高劑量組大鼠BWT評分均顯著高于灌胃前及模型組(P均<0.05)，且銀杏葉提取物中劑量組高于低劑量和高劑量組(P均<0.05)。見表1。

2.2各組大鼠腦組織形態學表現假手術組腦組織神經細胞核呈藍紫色，細胞膜及核膜清晰，核仁明顯，無水腫表現，見圖1。而模型組腦組織明顯水腫，而且神經元變性壞死明顯，神經元呈現腫脹或皺縮狀態，核仁基本消失，胞漿呈強烈嗜伊紅性，胞漿與核膜邊界不清，可見較多炎性細胞浸潤，見圖2。銀杏葉提取物低、中、高劑量組腦組織神經細胞水腫程度及胞漿濃縮較模型組均明顯減輕，其中以銀杏葉提取物中劑量組減輕最為明顯，見圖3～5。

表1　各組大鼠神經行為學評分比較±s，分)

注：①與假手術組比較，P<0.05；②與灌胃前比較，P<0.05；③與模型組比較，P<0.05；④與銀杏葉提取物中劑量組比較，P<0.05。

圖1　假手術組大鼠腦組織形態學表現(×200)

圖2　模型組大鼠腦組織形態學表現(×200)

圖3　銀杏葉提取物低劑量組大鼠腦組織形態學表現(×200)

2.3各組大鼠VEGF mRNA半定量假手術組VEGF相對表達量為2.854 9±0.154 9，模型組為4.537 2±0.684 2，銀杏葉提取物低劑量組為11.427 0±0.224 2，銀杏葉提取物中劑量組為18.9857±0.1983，銀杏葉提取物高劑量組為12.2013±0.243 6。模型組VEGF mRNA表達量明顯高于假手術組(P<0.05)，銀杏葉提取物低、中、高劑量組VEGF mRNA表達量均明顯高于模型組(P均<0.05)，且銀杏葉提取物中劑量組VEGF mRNA表達量均明顯高于低劑量組和高劑量組(P均<0.05)。

圖4　銀杏葉提取物中劑量組大鼠腦組織形態學表現(×200)

圖5　銀杏葉提取物高劑量組大鼠腦組織形態學表現(×200)

2.4各組大鼠VEGF蛋白表達情況假手術組VEGF蛋白表達IOD值為208.65±39.58，模型組為408.47±34.21，銀杏葉提取物低劑量組為685.13±94.22，銀杏葉提取物中劑量組為917.78±85.24，銀杏葉提取物高劑量組為746.48±83.49。模型組VEGF蛋白表達量明顯高于假手術組(P<0.05)，銀杏葉提取物低、中、高劑量組VEGF蛋白表達量均明顯高于模型組(P均<0.05)，且銀杏葉提取物中劑量組VEGF蛋白表達量均明顯高于低劑量組和高劑量組(P均<0.05)。

3　討　　論

腦中風是目前危害人類健康的重要疾病之一，聯合國世界衛生組織曾調查57個國家死亡人群，結果顯示死于腦血管病者竟高達11.3%。在我國，腦血管病、心臟病及癌癥是造成患者死亡的三大疾病，而腦血管病居三大死因之首[8]。我國每年有急性腦血管病例約150萬，缺血性腦中風是最主要的原因[9]。

缺血性腦中風之所以發生是因為血管阻塞后造成局部腦血流量減少，從而對神經組織造成損傷。腦缺血后半暗區的神經細胞處于低氧狀態，神經細胞凋亡，而及時恢復半暗區的血流供應，抑制腦部神經細胞凋亡可改善患者的神經功能[10]。VEGF是由2個相同亞基組成的一種多功能促血管內皮細胞生長因子，具有促進內皮細胞增殖，誘導血管生成，抗血栓，抗內皮細胞損傷和凋亡以及神經保護等作用，在胚胎發育、缺血性心腦血管疾病的發病和防治中具有重要意義。在缺氧缺血條件下，機體組織VEGF表達上調，其作用機制可能為：缺氧誘導因子(HIF-1)誘導啟動VEGF的轉錄，氧氣和生長因子可以調節HIF-1，從而激活正常的缺氧感受基因，使得VEGF表達增加；缺氧能顯著延長VEGF mRNA在體內的半衰期，從而間接提高VEGF的生理活性[11]。隨著人們對局灶性腦缺血病研究的深入，VEGF在缺血性腦中風中的作用逐漸成為人們研究的熱點。

中醫認為缺血性腦中風的基本病機為腎精虧虛，瘀血阻竅。銀杏葉是中國傳統名貴中藥材之一，具有兩千多年的應用歷史。有醫書記載銀杏葉提取物具有活血化瘀、通絡等功效，從上個世紀60年代開始，國內外眾多學者開始對銀杏葉的化學成分及藥理作用進行研究。20世紀80年代研究人員發現銀杏葉提取物具有抗缺氧、抗腦水腫和改善腦功能等作用，從而廣泛應用于腦缺血等疾病中。現代研究表明，銀杏葉提取物中主要化學成分為黃酮苷(24%)和萜類內酯(6%)，具有清除氧自由基、拮抗血小板活化因子、抑制一氧化氮合酶、改善能量代謝障礙、拮抗興奮性氨基酸毒性等作用，從而對腦缺氧缺血起到保護作用[12-14]。然而，銀杏葉提取物對局灶性腦缺血疾病的修復以及VEGF基因表達的影響鮮有報道。

本研究結果顯示，銀杏葉提取物能明顯改善腦缺血大鼠的神經功能，而且中劑量銀杏葉提取物對大鼠的神經功能改善情況最為顯著；通過對大鼠腦內VEGF mRNA和蛋白的表達檢測證明，銀杏葉提取物能顯著上調VEGF mRNA和蛋白的表達水平，而且中劑量銀杏葉提取物效果最好，這與銀杏葉提取物對大鼠神經功能改善結果一致；大鼠腦組織HE染色結果證實銀杏葉提取物能改善急性腦缺血大鼠神經功能損傷，減輕急性腦缺血時腦組織缺血區的組織形態學改變。以上結果說明銀杏葉提取物能夠改善局灶性腦缺血大鼠的神經功能，可能與上調大鼠腦組織中VEGF mRNA及蛋白的表達有關；此外銀杏葉提取物對缺血性腦損傷的改善程度與給藥劑量有關。

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Effects of Ginkgo Biloba extract powder on expression of VEGF in brain tissue after focal cerebral infarction in rats

ZHU Meie,GONG Daokai

(Jingzhou Hospital Affiliated to Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Jingzhou 434000,Hubei,China)

Objective It is to observe the effects of Ginkgo Biloba extract powder on neurobehavior and expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) mRNA and protein in brain tissue of rats after focal cerebral infarction.Methods The ischemic models were established with line embolism method.24 successful modeling Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into model group,Ginkgo Biloba extract powder groups (low,middle and high dosage),each group had 6 rats,and 6 normal rats were selected as sham operation group for comparison.Low,middle and high dosage of Ginkgo Biloba extract groups were given Ginkgo Biloba extract injection 0.9,1.8,2.7 mL/100 g respectively by lavage,while sham operation group and model group were given normal saline by lavage once per day.All the treatments lasted for 14 days.Beam walking test was adopted to evaluate the SD rat's neural behavior and HE staining was used to observe the rat brain morphological changes.VEGF mRNA and proteins expression were measured by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and immunohistochemical methods respectively.Results The scores of Ginkgo Biloba extract powder groups(low,middle,high dosage)were respectively higher than that in model group after 7 and 14 days' treatment(P<0.05),and the scores in middle dosage group were higher than that in low or high dosage groups (P<0.05).The result of HE staining showed that Ginkgo Biloba extract powder could change the brain morpholody of rats.The expressions of VEGF mRNA and protein in model group was higher obviously than that in sham operation group (P<0.05),the expressions of VEGF mRNA and protein in Ginkgo Biloba extract powder groups(low,middle,high dosage)were respectively higher than that in model group (P<0.05),and the expression in middle dosage group was higher than that in low or high dosage groups (P<0.05).Conclusion Ginkgo Biloba extract powder could improve neurogenic function and up-regulate the expressions of VEGF in rats with focal cerebral ischemia,which may be a main mechanism of its neuroprotection against cerebral ischemia injury,and the improving effects were related with therapy dosage.

Ginkgo Biloba extract powder; focal cerebral infarction; vascular endothelial growth factor

朱美娥，女，碩士，主治醫師，主要從事腦血管病及周圍神經病診治工作。

10.3969/j.issn.1008-8849.2016.28.009

R-332

A

1008-8849(2016)28-3107-04

2015-12-12