胰腺癌中miRNAs、mRNAs基因表達譜分析

白雪峰，劉躍娟，齊 靖，張 建

（哈爾濱醫科大學大慶校區醫學信息學院，黑龍江大慶，163319）

胰腺癌中miRNAs、mRNAs基因表達譜分析

白雪峰，劉躍娟，齊 靖，張 建

（哈爾濱醫科大學大慶校區醫學信息學院，黑龍江大慶，163319）

本文研究miRNAs、mRNAs在胰腺癌中的調控機制。通過對胰腺癌表達譜進行分析，基于生物信息學方法，建立miRNAs-mRNAs網絡，通過模塊挖掘獲得5個功能顯著性模塊，網絡中結點度較大的HUB節點miRNAs，這些結點與胰腺癌的發生、發展密切相關。對每個模塊進行聚類分析，得到度數小卻聚集的集合，這些基因也和胰腺癌密切相關。對這些模塊進行功能注釋，多個模塊注釋到代謝相關的功能上，表明胰腺癌與代謝密切相關；另外，多個模塊中具有多個相同功能注釋，多個調控相反的功能在同一模塊當中出現。這表明在組織自身原來就存在著平衡調控機制。通過本文的研究得到miRNAs與mRNAs協同作用的一些結果，為今后更深入的研究胰腺癌提供指導和借鑒。

胰腺癌；miRNAs；mRNAs；協同

0 引言

胰腺癌（pancreatic cancer，PC）因其起病隱匿、早期診斷難、手術切除困難、放化療不敏感以及預后差、死亡率高等原因，成為危害最大的惡性腫瘤之一，其中90%以上為胰腺導管腺癌。因此，深入了解胰腺癌發生發展的分子機制，發現新的潛在治療靶點尤為重要［1-2］。

近幾年的研究表明，miRNA的表達水平與人類重大疾病如癌癥等密切相關。這使得miRNA可以作為新的生物標志物用于癌癥等重大疾病的早期診斷并可作為新的基因藥物作用靶點。

最近，研究發現miRNA在胰腺癌中存在多個異常表達，有的是在胰腺癌癌前病變中研究中發現的［7-8］；有的是在胰腺癌組織標本中研究發現的；還有的是在胰腺癌病人血清中研究中發現的［9-10］。因此研究者認為這些差異表達的miRNA或許會為研究胰腺癌提供新的線索。

目前，雖然識別出一些與胰腺癌發生發展關系密切的miRNAs和mRNAs，但大部分miRNAs和mRNAs在胰腺癌中的作用還是未知的。本研究從miRNA、mRNA表達譜數據，構建胰腺癌疾病網絡，進行失調網絡的模塊挖掘，初步探索其作用機制，為揭示胰腺癌發生發展過程中miRNA與mRNAs的關系和調控作用機制提供新的線索，為胰腺癌的生物治療提供理論依據。

1 miRNA與動脈粥樣硬化

1.1 數據準備

從 NCBI上下載mRNA芯片數據（GSE43795）和miRNA芯片數據（GSE43796），兩種芯片包括相同的11病人樣本（5 normal/6 PCA），數據處理得到30500個mRNA和1205miRNA。差異基因的選取通過SAM算法獲得，通過R代碼進行數據處理，選取差異表達的mRNA和miRNA（q-value>0.001和q-value>0.05），得到1585mRNAs和106個miRNAs，這些差異表達的mRNAs和miRNAs作為胰腺癌的潛在致病因素。miRNAs與mRNA的互作對從HMDD數據庫下載，與疾病相關的miRNAs為117，與胰腺癌miRNA芯片取交集共有miRNAs92個，這些數據將用做以后分析使用。對獲得的疾病表達譜數據為獲得更多關于胰腺癌生物學信息，通過以下步驟行處理（圖1）。利用差異表達的mRNAs和在HMDD數據庫miRNA調控的mRNAs映射到KEGG通路當中，通過Subpathway-GM進行子通路挖掘，最終形成mRNAs-miRNAs互作網絡。用Cytoscape插件對網絡進行功能模塊挖掘，獲得5個功能顯著性模塊，最后通過David進行基因的功能注釋。

1.2 表達譜網絡分析

利用Subpathwaymine 進行子通路重構，合并子通路形成miRNA-mRNA互作網絡，結點數731個，其中包括mRNAs和mRNAs（91/640），3030條邊。點表示基因，邊表示兩個基因間的聯系，在網絡中，度越大的基因連接的邊越多，表明在網絡中可能起到HUB結點的作用。另外，還有一些結點雖然度小，但在結點間傳輸起到重要作用的橋梁作用，這些結點的關系，可能作為PCA中的潛在的致病基因。

圖1 數據分析流程圖

1.3 網絡模塊挖掘

利用Cytoscape中的JActivemodule插件進行模塊挖掘。獲得5個功能性顯著模塊（module1～module5）。用ClusterOne進行對模塊進行聚類，尋找顯著性miRNA-mRNA互作對（p-value<0.05）。

1.4 Gene ontology（GO）分析

通過David在線平臺完成對模塊中重要結點進行功能分析，篩選出具有診斷意義的顯示miRNA-mRNA關系對。

miRNAs在許多疾病的發生與發展中扮演了重要的角色，有研究證明，在疾病中miRNAs對mRNAs的調控行使著重要的生物學功能。通過以上步驟進一步對胰腺癌中miRNAs對mRNAs的調控關系做出探索。

2 結果

2.1 差異表達miRNAs、mRNAs

對PCA表達譜數據進行處理，得到差異表達的mRNAs、miRNAs數量分別為1585、106個。取表達譜差異的mRNAs、miRNAs前5%做熱圖，結果如圖2所示。在miRNAs表達譜的熱圖中，module1中顯著表達的有mir-320c；module2包括:mir-222、mir-92b、mir-320c；moudule3則有mir-320c、mir-320b、mir-654、mir-92a、mir-92b；module4含有mir-222、mir-320c、mir-92b；module5未出現上述熱圖中的miRNAs。通過比較可知，表達譜中mir-222在兩個模塊中出現，mir-92b在三個模塊中出現，而mir-320c在module1～module4模塊中全部出現。研究表明［11］mir-222通過靶向p57控制癌細胞的增殖。而mir-92b在胰腺癌的研究中未有文獻報道，mir-92b在膀胱癌中僅對癌細胞轉移和浸襲起作用，卻不會促使細胞的增殖［12］。miR-222可能通過MAPK信號轉導通路參與胰腺癌細胞侵襲轉移的調控［13］。文獻［14］報道mir-320c可能是通過另外一種模式lncRNA-mi RNA-mRNA進行調控。

圖2 mRNAs和miRNAs表達譜熱圖

在mRNAs表達譜的熱圖中，module2中顯著表達的有YWHAH；module3中含有GLS2、YWHAH；module4含有IFNA16；module5出現熱圖中ACADL、YWHAH。通過比較可知，表達譜中YWHAH在moudule2、moudule3、moudule5中出現。 促血管形成Gremlin 1 通過綁定YWHAH可能發揮著致癌作用，這一結果在宮頸癌肺癌、卵巢、腎、乳腺癌、結腸、胰腺癌中得到證實，Gremlin 1結合目標蛋白YWHAH可能為人類癌癥的提供新的診斷和治療方案［15］。ACADL顯著表達與胰腺固狀瘤有關［16］。而GLS2蛋白質對腫瘤的生長有抑制作用［17］。

2.2 miRNAs-mRNAs網絡模塊

癌癥屬于復雜疾病，對建立的疾病網絡已經證明顯現冪律分布［18］，從網絡分析來看，網絡中結點度越大的點，表明可能會影響更多的鄰居結點，因此，這些點被考慮扮演hubs結點的角色。圖3顯示miRNAs-mRNAs網絡結點的度分布是冪律分布。通過模塊挖掘來研究miRNAs、mRNAs在癌癥當中的共調控方式、以及基于局部策略來分析miRNAs的在胰腺癌中的功能。

圖3 網絡度分布

根據得到的5個功能模塊當中（圖4），大部分miRNAs具有較大的度（表1），如:mir-615、mir-222、mir-93-5p、mir-415-3p、mir-877等。在各個模塊中有些結點的度較大，mir-93-5p在5個模塊中度分別為:19、19、23、26、20；mir-222在模塊二、四、五的度數為:15、12、15；mir-24在模塊二、三、四、五分別為:18、19、18、13；mir-98在模塊四、五都為45。mir-615-3p在模塊一、二結點度為61、和65。有意思的是，研究證明hsa-miR-615-5p其異常表達可能與胰腺癌的發生、發展、浸潤、轉移有關，mir-615-5p對胰腺癌有抑制作用［19］，而在前面表達譜數據中mir-615-5p是下調的，mir-615-3p是上調的；mir-615-5p、mir-615-3p分別通過不同的方式來調節mRNAs表達。

表1 模塊中的邊和點

在五個模塊中，對模塊進一步分析，通過clusterone插件對模塊進行挖掘，通過挖掘每個模塊中重要節點用紅色標出，這表明除了度大的點起到了HUB結點的作用，在網絡中還有一些結點度雖然小，在局部聯系較為緊密，成為一個團隊發揮著作用，這些合作的結點可能在疾病發生過程中起到作用。在模塊一中RPL32、mir-186-5p、RPL27、RPL29、mir-652-3p聚在一個集合中，在這個小集合中，在狗身上檢測到RPL32在各組織上表達都是穩定的［20］，在胰腺癌中mir-186 -5p影響細胞增殖和轉移［21］，mir-652與ZEB1結合抑制胰腺癌腫瘤細胞上皮間質（EMT）的酸性微環境，酸性/ mir-655/ZEB1/EMT可能是腫瘤發生的新機制［22］。模塊二中YWHAH、FOXO3、CDC25C、YWHAB、YWHAZ構成的集合中，YWHAH、FOXO3、CDC25C與胰腺癌密切相關［15］［23］［24］。從模塊二中還可以看到YWHAH和mir-186直接相連，FOXO3和mir-615-3p直接相連，mir-615-3p在模塊中起到了HUB結點的作用。另外mir-744、RAN、EIF4G1作為一組聯系緊密的集合被發現，miR-744 發現成為新的預后標記物［25］，而RAN通過AR和CXCR4調控胰腺癌的侵襲和轉移［26］。RAN也與mir-615-3p直接相連。模塊三中mir-10a、mir-320c、LDHA、MT-CO3被聚在一起，DNMT3A綁定HK1和LDHA，而這兩個基因作為代謝開關，動物實驗表明敲降這兩個基因會引起dnmt3a缺失，進一步證明了DNA甲基化與胰腺β細胞的功能直接作用關系［27］。MT-CO3與糖尿病有關［28］。過表達mir-10a會抑制HOXA1并引起胰腺癌局部侵襲［29］。通過研究表明，mir-320c通過SMARCC1在治療胰腺癌中對藥物吉西他賓（gemcitabine） 產生抗藥性［30］。模塊四當中發現新的集合mir-122-5p、EGLN3、EPAS1，其中mir-122與多個miRNAs篩選作胰腺癌血液中的標記物［31］；EGLN3與胰腺癌腫瘤細胞的分化、增殖有關［32］；干擾EPAS1用作治療胰腺癌疾病［33］。模塊五中YWHAH、FOXO3、CDC25C、YWHAB、YWHAZ與模塊二中的集合相同，mir-125a-5p、TCEB2、EPAS1單獨聚在一起，降低mir-125a-5p的表達，會抑制胰腺腫瘤的增殖和細胞周期，并促進早期癌細胞的凋亡［34］。TCEB2m則可能用于卵巢癌的治療［35］。

2.3 模塊功能分析

五個模塊分別進行GO功能注釋（圖5），以上五個模塊注釋來看，在多個模塊或同一模塊當中多次出現注釋到一對相反的功能上，如:positive regulation of biological process和process、negative regulation of biological process；positive regulation of metabolic process、 negative regulation of metabolic process等，這表明在組織自身原來就存在著平衡調控機制，這些功能的失衡可能會引起疾病發生。多個模塊注釋到代謝相關的功能上，從功能上說明疾病也與代謝密切相關。另外除了細胞周期的功能之外，還有甲基化功能也被注釋。通過功能注釋表明多個基因通過協同在多個模塊中來行使某一功能，而多個相同的功能可能通過多個基因在不同的途徑下實現。

圖4 miRNAs-mRNAs模塊圖

圖5 模塊功能注釋

3 結語

為了明確胰腺癌中miRNAs與mRNAs如何行使調控作用，通過對胰腺癌芯片數據進行分析，得到miRNA-mRNAs網絡，對網絡進行模塊挖掘獲得5個顯著性模塊，對模塊進行分析，mir-615-3p、mir-222、mir-93-5p、mir-415-3p、mir-877在網絡中起到了HUB節點的作用，其中mir-222在表達譜中差異表達。在模塊當中還有一些節點度雖然比較小，通過聚類方式發現這些結點以“團隊”合作的方式行使功能，如:YWHAH、FOXO3、CDC25C、YWHAB、YWHAZ，通過文獻也發現這些成員與胰腺癌的發生都有密切關系。從功能上多個模塊中出現相反的功能注釋，如:positive regulation of cellular process、negative regulation of cellular process。一方面表明這些模塊中存在著的行使相同功能的基因，另一方面也表明，在同一模塊當中一些基因在平衡著這些功能起到重要作用。從功能注釋到甲基化，說明癌癥的發生機制十分復雜，是多階段、多因素復雜作用的結果。

最后，通過本文的研究，發現miRNAs與mRNAs協同作用的一些結果，為今后更深入的研究胰腺癌提供指導和借鑒。

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miRNAs and mRNAs gene expression profile analysis in pancreatic cancer

BAI Xue-feng， LIU Yue-juan， QI jing， ZHANG jian
（Department of Medical Informatics， Harbin Medical University， Daqing， 163319， China）

In this paper，we study miRNAs-mRNAs regulatory mechanism about pancreatic cancer。Application of bioinformatics method，we set up the miRNAs-mRNA disease network by the pancreatic cancer expression profile，and obtain five significance functional module by mining module of plugins .The larger degree nodes of miRNAs play a role HUB node in this network，while these are closely related to the initial and development of pancreatic cancer. whereafter use of clustering method to each module. the small degree nodes are gathered a collection，of these are more closely related to pancreatic cancer. The GO annotation of genes showed that pancreatic cancer was closely correlated to the metabolism function； moreover，many of same functional annotation appear in multiple modules，while many contrary of functional annotation appear in the single module. This suggests that there is a balance in its original regulatory mechanism.In this paper，achieved some synergy results about of miRNAs-mRNAs，these results may provide reference and help for future disease research on pancreatic cancer。

Pancreatic cancer；mRNAs；mRNAs；Synergy

黑龍江省衛生廳科研課題（編號:2013116）

白雪峰，男，講師，主要研究方向生物信息學。