β-煙堿標準樣品研制

王　尉，林　楠，周明強，樂勝鋒，杜　寧，張經華

(1.北京市理化分析測試中心，北京 　100089；2.全國標準樣品技術委員會天然產物標準樣品專業工作組，北京 　100094；3.有機材料檢測技術與質量評價北京市重點實驗室，北京　100094)

?

β-煙堿標準樣品研制

王尉1,3，林楠1,3，周明強1,3，樂勝鋒1,3，杜寧1,2,3，張經華1,2*

(1.北京市理化分析測試中心，北京 100089；2.全國標準樣品技術委員會天然產物標準樣品專業工作組，北京 100094；3.有機材料檢測技術與質量評價北京市重點實驗室，北京100094)

依據GB/T 15000 標準樣品工作導則，開展了β-煙堿國家標準樣品研制工作。采用溶劑提取、萃取、柱色譜、水蒸汽蒸餾等方法制備β-煙堿樣品，通過UV，IR，MS 和NMR 等方法對β-煙堿樣品進行結構鑒定，并進行均勻性、穩定性檢驗。采用8 家實驗室進行聯合定值，對定值結果進行數據分析。β-煙堿標準樣品的均勻性和穩定性良好，定值結果為99.12%，置信度95%的擴展不確定度為0.64%。所制得的β-煙堿樣品滿足標準樣品工作導則的要求，可用于有關煙草產品中β-煙堿的檢測，以及相關產品的質量控制。

β-煙堿；煙草；標準樣品；均勻性；穩定性；定值

煙草中約含有50 種生物堿，存在于60 多個不同品種的煙草中[1]，如煙堿、新煙堿、新煙草堿、降煙等[2-3]。其中煙堿又稱尼古丁，作為煙草中一種特有的生物堿成分，其含量約占煙草生物堿總量的95%，占煙草干重的0.5%～6.0%，是評價煙葉品質的主要指標，也是衡量香煙吃味的主要指標[4]。煙堿在自然界中有3種異構體，分別為α-煙堿、β-煙堿和γ-煙堿，煙草中主要為β型[5]。

β-煙堿具有十分廣泛的用途，該系列的農藥屬植物殺蟲劑，是生產綠色食品的高效殺蟲劑和生物性農藥[6-8]。它還廣泛應用于醫藥工業，是研制治療心血管[9]和腦部疾病[10]藥物的原料，并具有抗疲勞[11]、抗感染[12]等生理功效。高純度的β-煙堿作為煙草行業的添加劑，能提高香煙品質，制作卷煙代用品[13-14]。

市場上的煙草相關產品種類繁多，其中β-煙堿含量的檢測需要其標準樣品作為對照，且在煙草的相關研發中也需標準樣品作為研究對象。但目前國內尚無β-煙堿標準樣品，因此迫切需要開展該標準樣品的研制工作。本文依據GB/T 15000 標準樣品工作導則，對制備得到的高純度β-煙堿進行了純度分析、結構確認、穩定性檢驗、均勻性檢驗、定值工作，最終申報獲批成為國家標準樣品。

1　實驗部分

1.1儀器與試劑

LC-20A高效液相色譜系統(日本島津公司)，配SPD-M20A檢測器；GCMS 2010氣相色譜質譜儀(日本島津公司)；LC/MSD Trap液相色譜質譜儀(美國安捷倫公司)；UV-2550紫外可見分光光度計(日本島津公司)；Spectrum400傅立葉變換紅外-近紅外光譜儀(美國珀金埃爾默公司)；AVANCE 600超導脈沖傅立葉變換核磁共振波譜儀(德國Bruker公司)。

鹽酸、甲醇、乙酸、氨水、氯仿、無水硫酸鈉(北京化工廠)；乙腈、乙酸銨(美國Fisher Scientific公司)；實驗用水為超純水。煙葉B2F(河北中煙工業有限責任公司)。

1.2實驗方法

1.2.1β-煙堿樣品的制備及分裝將煙葉粉碎至40目，用鹽酸水溶液(pH 3.0)超聲提取3次，料液比為1∶10，每次15 min，合并濾液，減壓濃縮；再用氨水調至pH>10.0，以氯仿萃取3次，合并有機相，用鹽酸水溶液(pH 3.0)反萃取3次，合并水相上732型強酸性陽離子交換樹脂，氨水洗脫；然后進行水蒸汽常壓蒸餾，鹽酸水溶液回收，回收樣品用氨水調至pH>10.0，氯仿萃取，去除氯仿后，用無水硫酸鈉脫水，最終制得β-煙堿樣品。

在相對獨立和潔凈空間，將β-煙堿樣品采用1 mL棕色安瓿瓶進行充氮分裝。以每瓶200 mg分裝，用十萬分之一天平稱量，共100瓶樣品，記為1～100號。分裝好的樣品瓶置于4 ℃冰箱中長期保存。

1.2.2純度分析配制濃度為0.5 mg/mL的β-煙堿樣品溶液，采用高效液相色譜(HPLC)、氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)、峰面積歸一法等方法對β-煙堿進行純度分析。

首先，采用HPLC等度和梯度兩種洗脫方式，并采用HILIC，C18，氨基柱等不同色譜柱，以及全波長檢測對β-煙堿進行純度分析。HPLC分析條件為：流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長260 nm；進樣量5 μL。

GC-MS分析條件：DB-5ms色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；流速1.2 mL/min；進樣口溫度：300 ℃；進樣方式：分流 50∶1；升溫程序：40 ℃保持3 min，以35 ℃/min升至180 ℃，再以8 ℃/min升至300 ℃，保持8 min；進樣量：1 μL。

β-煙堿純度的測定：依據《YC/T 247-2008 煙草及煙草制品 煙堿純度的測定 硅鎢酸重量法》[15]對β-煙堿進行純度測定。平行取樣5份，經硅鎢酸沉淀、過濾、稱重，以β-煙堿的質量分數計算其純度值。

1.2.3結構鑒定UV分析條件：甲醇為溶劑，掃描范圍200～400 nm；IR分析條件：KBr壓片法，掃描范圍650～4 000 cm-1。MS分析條件：電噴霧離子源，采用正離子模式，噴霧器壓力50 psi，脫溶劑氣為氮氣，溫度350 ℃，流量10 L/min。NMR分析條件：溶劑為氘代氯仿(CDCl3)，采集1H NMR和13C NMR譜圖。

1.2.4均勻性、穩定性、定值研究依據GB/T 15000.3—2008《標準樣品工作導則(3)標準樣品：定值的一般原則和統計方法》[16]開展均勻性、穩定性、定值研究工作。

均勻性：通過隨機順序重復測量的方法，并采用單因素多水平試驗方差分析法進行純度均勻性檢驗。

穩定性：對β-煙堿樣品進行4 ℃，12個月的長期穩定性研究。分別于不同時間取樣檢測，采用直線作為經驗模型，觀察斜率值是否有顯著變化，預測β-煙堿的穩定性變化。

定值：采用8家實驗室HPLC峰面積歸一法對β-煙堿進行聯合定值。HPLC分析條件同“1.2.2 ”HILIC色譜柱等度洗脫條件。分別隨機取3個樣品進行檢測，每一樣品平行測試2次，對各實驗室的6個數據進行統計，計算β-煙堿標準樣品的標準值和不確定度。

2　結果與討論

2.1樣品制備

目前，對于β-煙堿的常用提取方法有水蒸氣蒸餾法、溶劑萃取法、酸/堿浸提法、離子交換樹脂法以及超臨界CO2流體萃取法等[17-19]。但上述方法得到的β-煙堿純度不高。本文通過優化組合提取純化方法，快捷、高效地從煙草中提取分離得到純度大于99%的β-煙堿，為標準樣品的研制提供了重要參考。

2.1.1樣品提取由于β-煙堿在煙葉中主要以有機酸鹽的形式存在，所以提取溶劑和pH值對提取率有重要影響，酸/堿浸提法是最常用的方法。本文利用鹽酸將水提液的pH值調至3.0，即可對有機酸鹽型和游離型β-煙堿進行全部的提取。與堿性條件下甲醇提取的方法相比，該方法具有成本低、綠色環保的特點。同時采用超聲輔助提取，大大提高了提取效率。

2.1.2β-煙堿的分離純化利用β-煙堿在堿性水相中呈游離態，易被有機溶劑萃取的特性，采用氯仿萃取可有效地去除提取溶液中單寧、蛋白質、果膠以及大部分有機酸成分；同時，在酸性條件下β-煙堿易被水相反萃取，因此經3次萃取-反萃取可得到含量為45%左右的鹽酸鹽型β-煙堿的粗提品。為進一步提高樣品純度，利用鹽酸鹽型β-煙堿帶正電的性質，采用732型強酸性陽離子交換樹脂進行吸附，氨水洗脫后，可有效去除樣品中的色素，富集生物堿類成分。通過水蒸汽常壓蒸餾將低沸點游離型的β-煙堿揮發，并用鹽酸水溶液回收，去除高沸點成分，可得到純度大于99%的鹽酸鹽型β-煙堿。

在生物堿類成分的分離純化中，所得樣品的形式(鹽或游離型)備受關注。為了得到游離型β-煙堿，采用氨水調節pH值，將鹽酸鹽型β-煙堿樣品轉化成游離型，并用氯仿萃取富集。通過低溫旋轉蒸發去除氯仿，無水硫酸鈉脫水后，可制得淡黃色透明油狀的β-煙堿樣品。

圖1　β-煙堿的三維色譜圖Fig.1　3D chromatogram of nicotine

2.2純度分析

2.2.1高效液相色譜法等度和梯度洗脫均使用Waters Atlantis HILIC(150 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱，流動相A為乙腈，B為10 mmol/L乙酸銨(含2%冰醋酸)；其中等度洗脫條件為：0～20 min，72%A；梯度洗脫條件為：0～40 min，90%～60%A。不同色譜柱對β-煙堿進行純度分析的條件分別為：DIKMA Diamonsil(250 mm × 4.6 mm,5 μm)C18色譜柱，流動相A為甲醇，B為0.002 5%三乙胺，0～40 min，50%A；Shodeks NH2-40 E(250 mm×4.6 mm,5 μm)氨基柱，流動相A為乙腈，B為0.5%磷酸，0～20 min，70%A。通過以上色譜方法相結合的方式進行純度分析，所得β-煙堿的純度結果具有較好的一致性。

另外，標準樣品純度分析常用的方法是面積歸一化法，但由于化合物種類不同，其紫外特征吸收波長也不同，單一的檢測波長往往會忽略雜質的存在，因此采用等度洗脫的條件，配備二極管陣列檢測器，采集了β-煙堿的三維色譜圖(圖1)，除溶劑峰外，其他波長下無明顯雜質峰出現。

2.2.2氣相色譜-質譜聯用法對于標準樣品中的雜質可能存在紫外檢測器無響應的情況，利用β-煙堿的揮發性質，采用GC-MS法對該樣品的純度進一步確定，GC-MS總離子圖中未發現明顯雜質峰，測得β-煙堿的純度為99.09%。

2.2.3硅鎢酸重量法利用硅鎢酸與β-煙堿反應生成不溶性煙堿硅鎢酸鹽的特點，直接稱重即可準確計算β-煙堿的純度。通過5次純度測定，得到β-煙堿的平均純度為99.01%。

實驗結果表明，硅鎢酸重量法和氣相色譜-質譜聯用方法的測定結果基本一致，證明本文所研制的β-煙堿具有較好的純度，適用于煙草及相關領域的化學分析和質量控制。

2.3結構確認

表1　β-煙堿的1H 和13C NMR測試結果Table 1　Results of 1H and 13C NMR spectrograms

2.4均勻性檢驗

采用隨機順序重復測量的方法，根據隨機數表，分別抽取10個樣品進行均勻性檢驗。按“1.2.2”純度分析方法，每個樣品平行檢測3次，以峰面積百分比讀取樣品的純度值。檢測數據進行方差分析，以F值檢驗，確定了β-煙堿樣品的均勻性良好。檢驗結果見表2～3。

表2　均勻性檢驗結果Table 2　Results of homogeneity

表3　均勻性檢驗方差分析結果Table 3　Results of variance analysis for the homogeneity

瓶間標準偏差是瓶間方差的平方根：Sbb=SA=1.36×10-4，均勻性檢驗引入的不確定度u均=Sbb=1.36×10-4。

2.5穩定性檢驗

按“1.2.2”純度分析方法，分別于0，3，6，9，12月檢測β-煙堿樣品，每個樣品平行檢測3次，以峰面積百分比讀取樣品的純度值。穩定性檢驗結果見表4。

采用直線作為經驗模型，觀察斜率值是否有顯著變化，以此對標準樣品的穩定性變化進行預測。

表4　穩定性檢驗結果Table 4　Results of stability

斜率可用下式計算：

取其平方根s=0.031 6%，與斜率相關的不確定度用公式計算：

自由度為n-2和p=0.95(95%置信水平)的分布t因子為3.128,由于|b1|

2.6定值結果

對聯合定值的8家實驗室所采集的測定結果，采用Grubbs檢驗法進行檢驗，未發現異常值。經過數據統計，計算得出β-煙堿標準樣品的標準值和不確定度。定值結果見表5～6。

表6　定值方差分析結果Table 6　Results of variance analysis for the certification

制備所得標準樣品定值結果的不確定度組成如下：均勻性檢驗引入的不確定度,穩定性檢驗引入的不確定度以及多個實驗室定值引入的不確定度。

在置信概率為95%時，k=2，則擴展不確定度UCRM=2uCRM=0.32%×2=0.64%。

3　結　論

針對我國尚無β-煙堿國家標準樣品的現狀，開展了該標準樣品的研制工作，成功建立了β-煙堿樣品的制備方法。并依據GB/T 15000標準樣品工作導則，對制得的β-煙堿樣品進行均勻性檢驗、穩定性檢驗及定值研究，最終申報獲批成為國家標準樣品。

β-煙堿標準樣品的標準值為99.12%，擴展不確定度(95%置信區間)為0.64%。該標準樣品符合GB/T 15000標準樣品工作導則要求，填補了國內該領域研究的空白，不僅滿足煙草及相關產品分析檢測、質量控制工作的需求，也為檢測結果的準確性、可比性以及溯源性提供了技術支撐。

[1]Rao G H，Zhao M M，Lin W F，Yang X Q.Resour.Sci.(饒國華，趙謀明，林偉鋒，楊曉泉．資源科學)，2005，27(5)：120-127.

[2]Dong E H，Tan H，Bao N，Yuan X，Ma K,He J L.GuangzhouChem.Ind.(董二慧，譚紅，包娜，袁鑫，馬凱，何錦林．廣州化工)，2012，40(15)：33-35.

[3]Shi J L，Pang T，Li Y，Song Z B，Gao Y L，Wang B W，Song C M.J.Instrum.Anal.(師君麗，逢濤，李勇，宋中邦，高玉龍，王丙武，宋春滿．分析測試學報)，2014，33(3)：334-338.

[4]Xue X P，Chen Y，Wang M S，Pan W J，Li J X.J.AnhuiAgric.Sci.(薛小平，陳懿，王茂勝，潘文杰，李繼新．安徽農業科學)，2008，36(10)：4121-4123.

[5]Ma J B.GuangdongChem.Ind.(馬俊勃．廣東化工)，2011，38(10)：33-35.

[6]Zeng X，Ni J P，Ma Y F，Shi J J，Yan L，Ni L B.Mod.Agrochem.(曾霞，倪玨萍，馬亞芳，施娟娟，嚴柳，倪龍博．現代農藥)，2013，12(6)：1-5.

[7]Lü C J，Zhong B Z，Qian J，Gou Z H，Qin W Q.J.Biosaf.(呂朝軍，鐘寶珠，錢軍，茍志輝，覃偉權．生物安全學報)，2013，22(3)：201-205.

[8]Liu J N，Huang H P，Hua J Z，Zhang Y Y，Yao L Y.GuizhouAgric.Sci.(劉佳妮，黃鶴平，華金珠，張瑜瑜，姚麗媛．貴州農業科學)，2015，43(3)：78-81.

[9]Jia B，Xu H P，Zhang R X，Li G R，Liu Y，Fu L.Chin.J.Crit.CareMed.(賈寶，徐宏平，張瑞星，李國榮，劉艷，付莉．中國急救醫學)，2013，33(2)：168-170.

[10]Zhang Z N，Zhang G Z.ActaTabacariaSin.(張真娜，張桂治．中國煙草學報)，2013，19(6)：114-119.

[11]Hou X D，Lin X Y，Zhang H B，Du Y M，Jiang Y.Chin.TobaccoSci.(侯小東，藺新英，張懷寶，杜詠梅，姜迎.中國煙草科學)，2014，35(6)：90-92.

[12]Li K，Wu C T.Chin.J.Exp.Surg.(李錕，吳承堂．中華實驗外科雜志)，2015，32(4)：743-744.

[13]Zheng K L，Yu D M.J.ChongqingUniv.(鄭奎玲，余丹梅．重慶大學學報)，2004，27(3)：61-64.

[14]Chu Z B，Shui H F，Chen J M.Appl.Chem.Ind.(儲志兵，水恒福，陳建民．應用化工)，2007，36(1)：102-104.

[15]YC/T 247-2008.Tobacco and Tobacco Products-Determination of Nicotine Purity-Gravimetric Method Using Tungstosilicic Acid.Tobacco Industry Standards of the People′s Republic of China(煙草及煙草制品 煙堿純度的測定 硅鎢酸重量法．中華人民共和國煙草行業標準).

[16]GB/T 15000.3-2008.Directives for the Work of Reference Materials Reference(3)-Materials-General and Statistical Principles for Certification.National Standards(3)-of the People's Republic of China(標準樣品工作導則：(3)標準樣品:定值的一般原則和統計方法.中華人民共和國國家標準).

[17]Yang Y K，Li X M，Zhou J，Xu L L，Yang T.TobaccoSci.Technol.(楊葉昆，李雪梅，周瑾，徐蘭蘭，楊濤．煙草科技)，2006，1：38-40.

[18]Liu B F，Xiang X K.FineChem.(劉本發，向興凱．精細化工)，1998，1：55-57.

[19]Xu X M，Gao K D，Huang Q L.Chem.Adhes.(徐曉沐，高科達，黃伣麗．化學與黏合)，2006，1：50-53.

[20]Jeffrey I S，Jaya F,John B，Bruce E W.J.Agric.FoodChem.，1999，47(12)：5133-5145.

Development of Nicotine Certified Reference Material

WANG Wei1,3,LIN Nan1,3,ZHOU Ming-qiang1,3,LE Sheng-feng1,3,DU Ning1,2,3,ZHANG Jing-hua1,2*

(1.Beijing Centre for Physical and Chemical Analysis,Beijing100089,China；2.Specialistic Group on Natural Product of National Technical Committee on Reference Materials,Beijing100094,China；3.Beijing Key Laboralory of Detection Technology & Quality Evaluation of Organic Material,Beijing100094,China)

According to the directives for the work of reference materials GB/T 15000,nicotine certified reference material was prepared.Nicotine was prepared by extraction,column chromatography and steam distillation.Its chemical structure was identified by UV，IR，MS and NMR method.Its homogeneity and stability were systematically checked.A cooperative certification was conducted by 8 laboratories，and the results of certification for nicotine were analyzed.The homogeneity and stability of the nicotine reference material were good,and the certified value was 99.12% with expanded uncertainty of 0.64% in confidence coefficient of 95%.The reference material of nicotine conforms to directives for the work of reference materials,and it could be used for method validation and quality control of regarding products.

nicotine;tobacco;certified reference material;homogeneity;stability;certification

2016-03-28；

2016-04-09

國家質檢總局公益性行業科研發展專項(201210209)

張經華，博士，研究員，研究方向：天然產物分離純化，Tel：010-58717639，E-mail：wangwei_1217@126.com

分析測試技術與標準化

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.09.025

O657.63;O629.3

A

1004-4957(2016)09-1203-06