口腔癌患者尿液萘酚反應物的高效液相色譜熒光檢測法篩查

程廣強

(福建省測試技術研究所，福建　福州　350003)

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口腔癌患者尿液萘酚反應物的高效液相色譜熒光檢測法篩查

程廣強*

(福建省測試技術研究所，福建福州350003)

利用高效液相色譜熒光檢測法(HPLC/FLD)對口腔癌患者尿液中的萘酚反應物(NNR)進行分離分析，通過對34例口腔癌患者和18例健康人尿液的NNR進行分析，比較了癌癥患者及健康人尿液中的成分含量差異，提出了一種可用于口腔癌輔助診斷的新方法。結果表明，在健康人及口腔癌患者尿液的萘酚反應物(NNR)中可檢出一種標記物，其激發波長為440 nm，發射波長為539 nm。該標記物含量在口腔癌患者中較低，而在健康人群中顯著偏高，這與通常的鑒定結果不同。通過采用非參數檢驗(Mann-Whitney U檢驗)，該標記物含量在健康人群與口腔癌癥患者中存在顯著性差異(P<0.01)，其特異度為94.1%，敏感度為94.4%，ROC曲線下面積(AUC)為0.989。該模型具有較高的診斷價值，能夠用于口腔癌的輔助鑒定。

口腔癌；尿液萘酚反應物；液相色譜熒光檢測(HPLC/FLD)；ROC曲線

尿液作為一種體液，具有重要的臨床檢驗價值，早已列為三大常規檢查的內容。由于其取樣簡單，對人體無傷害，是非常理想的樣本。尿液是多組分體系，包含很多人體代謝物，成分較為復雜，信息量較為豐富，因此通過分析尿液成分進行一些特殊疾病診斷的研究報道日益增多。尿液檢測研究已應用于胃癌[1-2]、肺癌[3-4]、肝癌[5-6]等癌癥檢測中，但靈敏度和特異性有限，用于口腔癌診斷的研究也鮮見報道。目前研究癌癥患者的尿液成分，主要利用尿液自身的特性，采用尿液自動分析儀或其他光譜、色譜、質譜手段進行檢測，如對尿液的自體特異性熒光進行檢測[7]；還有一些通過某種特定試劑(如亞硝基萘酚[8-9]等)與尿液中的成分反應生成特定產物，然后采用光譜、色譜、質譜等技術進行分析，確定反應物含量與癌癥的相關性。目前已有報道大多直接采用光譜法測量吸光度或者熒光強度，以研究亞硝基萘酚反應物(NNR)與各種癌癥的相關性，并對NNR的化學基礎與特異性有了較深入的研究[10]。由于尿液與亞硝基萘酚反應后，其成分更為復雜，反映出的吸光度變化或熒光強度變化是各種產物的綜合結果，因此籠統地用這些變化來確定與癌癥的相關性，具有一定的局限性。本文在已有研究[11]的基礎上利用高效液相色譜(HPLC)的高分離性能以及熒光檢測器(FLD)的高選擇性、高靈敏性來研究NNR，尿液樣品在一定條件下與亞硝基萘酚反應后形成NNR，NNR經HPLC分離后，用FLD進行選擇性檢測。在本文的色譜條件下，檢出一種與口腔癌密切相關的物質，其特異度為94.1%，敏感度為94.4%，ROC曲線下面積(AUC)為0.989，該模型具有較高的診斷價值。

1　實驗部分

1.1儀器與試劑

Waters 2695高效液相色譜儀，Waters 2475熒光檢測器，HHS-S恒溫水浴裝置(江蘇金壇市正基儀器有限公司)。所用試劑均為分析純，實驗用水為去離子水。

衍生試劑的配制：將200 mg/Lα-亞硝基-β-萘酚乙醇溶液、3.0 mol/L硝酸與0.1 mol/L亞硝酸鈉按2∶3∶3比例混合即得衍生劑。

1.2實驗方法

研究樣本均取自通過病理活檢確診的口腔癌患者，大多數病例均為口腔鱗癌或者舌癌，正常組均為非癌患者。均于入院第二天采集，囑尿液采集前一天晚飯后飲水勿超過1 000 mL，自行留取清晨第一次尿液50 mL，保存于聚乙烯塑料瓶中，容器外貼標簽(注明受檢人員姓名、編號、采集日期)，放入-20 ℃低溫冰箱內保存，共采集34例口腔癌患者和18例正常人的尿液樣本。取患者晨尿樣1.0 mL，加入等體積的衍生劑于55 ℃水浴保溫反應30 min后，吸取1.0 mL過0.45 μm濾膜后進樣分析。

1.3液相色譜分析條件

色譜柱：Symmetry C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，柱溫：30 ℃，柱壓：12 MPa；流動相：甲醇-水(50∶50)；流速：1.0 mL/min；熒光檢測條件：λex/λem=440 nm/539 nm,Gain：10。

2　結果與討論

2.1實驗條件的優化

2.1.1溫度對顯色反應的影響尿液中可與α-亞硝基-β-萘酚反應的成分較多，包括酪氨酸、5-羥-3-吲哚乙酸、愈創木酚衍生物、對羥酚取代物、尿高香草酸[12-14]等，均可形成NNR。本文采用酪氨酸為參考基準物質，反應時間為10 min，對衍生反應溫度進行優化。酪氨酸與α-顯色劑的顯色反應在室溫下進行緩慢且反應靈敏度較低，適當加熱有利于顯色反應的進行，根據各溫度下顯色產物熒光強度的對比，發現在55 ℃時，試樣完全顯色且顯色產物在一定時間內比較穩定，因此選擇加熱溫度為55 ℃。

2.1.2反應時間對顯色反應的影響 在最佳反應溫度(55 ℃)下考察了反應時間對顯色反應的影響，結果顯示，隨著反應時間的延長，衍生物的熒光強度逐漸增強，當反應時間為30 min時，衍生物的熒光強度達到最大，因此選擇最佳反應時間為30 min。

2.2液相色譜條件的優化

將上述衍生物進行高效液相色譜分離分析，以期尋找口腔癌患者與正常人尿液樣品中NNR的液相色譜熒光檢測譜圖差異，尋求合適的標記物用于診斷分析。結果發現，衍生物中一種NNR具有較強的熒光特性，其峰高值與口腔癌具有相關性。為獲得最佳的實驗效果，進一步對液相色譜的分離條件進行優化。

2.2.1色譜條件的優化比較了流動相中甲醇的體積分數對衍生物出峰時間的影響。結果表明，甲醇的體積分數越大，衍生物的保留時間越短，峰形越尖銳，當流動相中甲醇的體積分數為50%時，出峰時間在6.1 min左右，相對較為理想，因此選擇流動相中甲醇的體積分數為50%。

2.2.2檢測器的選擇 在最佳反應條件及色譜條件下，分別用紫外二極管陣列檢測器(UV)和熒光檢測器檢測，得到萘酚反應物的色譜圖見圖1。由圖1可見，采用UV檢測時，雖然口腔癌患者和正常人尿液樣品的譜圖中能顯示出有差異的色譜峰，但譜圖的干擾峰較多，其差異峰的純度不高，無統計學意義(圖1A)； 而采用熒光檢測時，口腔癌患者和正常人的尿液樣品譜圖中的色譜峰顯示具有明顯差異(圖1B)，且無雜質峰干擾，可作為口腔癌患者的特征標記物峰，故選擇使用熒光檢測器。

圖1　萘酚反應物的高效液相色譜紫外檢測色譜圖(A,λ=254 nm)與熒光檢測色譜圖(B,λex/λem=440 nm/539 nm)Fig.1　Chromatograms of NNR with UV detector(A,λ=254 nm) and FLD detector(B,λex/λem=440 nm/539 nm)

圖2　兩組人群實驗數據的散點圖Fig.2　Scatter diagram of two group people

圖3　ROC曲線圖Fig.3　ROC curve

2.3實際樣品檢測

對34例口腔癌患者和18例正常人尿液樣品中的NNR進行分離分析，選取保留時間6.1 min的峰為標記物，比較癌癥患者及健康人尿液中NNR含量的差異。結果表明，在口腔癌患者尿液中該標記物的熒光強度較低(未檢出～27.8×10-2V)，而在健康人群中則顯著偏高(10.0×10-2～84.0×10-2V)。將所得數據繪制散點圖(圖2)，從散點圖也可直觀看出兩組數據存在明顯差異。

2.4檢測結果的統計分析

ROC曲線為受試者工作曲線(Receiver operating characteristic curve,簡稱ROC曲線)，又稱感受性曲線(Sensitivity curve)，常用于醫學統計分析[15]。ROC曲線是反映特異度和敏感度連續變量的綜合指標，可揭示敏感度和特異度的相互關系，通過將連續變量設定出多個不同的臨界值，從而計算出一系列敏感性和特異性，再以敏感性為縱坐標，(1-特異性)為橫坐標繪制曲線，其曲線下面積(AUC)越大，診斷準確度越高。一般認為，當AUC為0.5～0.7時，有較低的準確性；0.7～0.9時，有一定的準確性；大于0.9時，有較高的準確性。本文采用SPSS13軟件，將檢測所得數據輸入軟件進行統計分析，繪制了ROC曲線(如圖3)。從圖3可以得出AUC為0.989，特異度為94.1%，靈敏度為94.4%，表明該模型具有很高的診斷價值。

3　結　論

本文建立了口腔癌患者尿液中NNR的高效液相色譜熒光檢測方法，方法具有很好的準確性。通過分析口腔癌患者和正常人尿液樣品中的NNR含量發現，兩組數據存在顯著性差異，說明此法用于口腔癌普查篩選具有一定意義。建立的ROC曲線，曲線下面積(AUC)為0.989，說明診斷效果較好，方法的特異度為94.1%，靈敏度為94.4%。

致謝：衷心感謝本課題組全體成員的努力，特別是本所的倪沁顏同志和福建中醫藥大學附屬人民醫院口腔科林耿冰醫生。同時也感謝本所蘇勤同志提供SPSS13.0軟件用于數據分析。

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Screening of Naphthol Reactant in Urine of Oral Cancer Patients by High Performance Liquid Chromatography with Fluorescence Detection

CHENG Guang-qiang*

(Fujian Institute of Testing Technology , Fuzhou350003,China)

A new aided diagnosis of oral cancer was developed for the separation and analysis of nitrosonaphthol reactant(NNR) of urine in oral cavity cancer patients by using high performance liquid chromatography with fluorescence detection(HPLC/FLD),based on the analysis of urine NNR of 34 cases of oral cancer patients and 18 healthy people and their difference of composition content.The experimental results showed that a marker with excitation wavelength of 440 nm and emission wavelength of 539 nm,could be detected in urinary nitrosonaphthol reactant(NNR) from healthy people and patients with oral cavity cancer under the condition of this paper.The marker content was relatively low in oral cancer patients and significantly high in healthy persons,which is quite different from the usual test results.Significant differences were found in the matter content in healthy people and those with oral cancer patients(P<0.01) using a non parametric test (Mann-Whitney U test).Further data analysis showed that the specificity was 94.1%,the sensitivity was 94.4%,the area under the ROC curve(AUC) was 0.989.The model showed a high diagnostic value,and could be used for the auxilary identification of oral cancer.

oral cancer；nitrosonaphthol reactants；high performance liquid chromatography with fluorescence detection(HPLC/FLD)；ROC curve

2016-02-01；

2016-03-10

福建省科技計劃項目公益類科研院所基本科研專項資助(2009R10002-1)

程廣強，碩士，高級工程師，研究方向：分析化學，Tel：0591-87872379，E-mail:1585920616@qq.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.09.024

O657.72；O625.313

A

1004-4957(2016)09-1199-04