硅膠柱與凝膠柱凈化/氣相色譜-質譜聯用測定植物葉片中多環芳烴

包奮強，安海龍，惠亞梅，張祥雪*，夏新莉*

(1.北京林業大學　理學院，北京　100083;2.北京林業大學　林木育種國家工程實驗室，北京　100083;3.中持依迪亞(北京)環境監測分析股份有限公司，北京　100192)

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硅膠柱與凝膠柱凈化/氣相色譜-質譜聯用測定植物葉片中多環芳烴

包奮強1，安海龍2，惠亞梅3，張祥雪1*，夏新莉2*

(1.北京林業大學理學院，北京100083;2.北京林業大學林木育種國家工程實驗室，北京100083;3.中持依迪亞(北京)環境監測分析股份有限公司，北京100192)

建立了索氏提取-硅膠柱和凝膠柱凈化/氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)測定植物葉片中多環芳烴的分析方法。葉片中的多環芳烴經二氯甲烷-正己烷(體積比1∶1)索氏提取，提取液采用硅膠柱和凝膠柱兩步凈化(手填硅膠柱和GPC柱)后，進行GC-MS測定，根據保留時間和特征離子進行定性，內標法定量。方法檢出限為0.025 1～5.80 ng/g，加標回收率為82.2%～130%，相對標準偏差不大于11%。該方法能有效去除植物葉片中的色素與油脂，適用于植物葉片中多組分多環芳烴的痕量分析，為測定植物組織內多環芳烴的含量提供了技術支撐。

索氏提取；硅膠柱；凝膠柱；多環芳烴；氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)；植物

多環芳烴(Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)是含有2個或2個以上苯環的具有致癌、致畸和致突變作用的有機化合物，也是一類普遍存在大氣環境中的有機污染物之一[1]。大氣中PAHs的來源可分為天然源和人為源，其中人為源為主要來源，如煤炭燃燒、汽車尾氣、鋼鐵和石油工業生產中的排放[2]。PAHs可通過食物鏈在動植物體內累積，從而嚴重危害人類健康[1]。

PAHs進入植物體主要有兩種途徑：土壤-植物體和空氣-植物體[3]。土壤中PAHs與有機質緊密結合，不易被植物根部吸收而進入植物體。而空氣-植物體是PAHs從空氣通過氣態和顆粒態沉降到葉片的蠟質表皮或通過氣孔吸收進入植物體[4-5]。因此，空氣-植物體是植物體富集PAHs的主要途徑[6]。目前，有關PAHs含量測定的研究對象主要是非植物介質，如水體、沉積物和顆粒物等[7-10]，也有研究分析了植物葉片中PAHs的含量特征，但測定植物葉片中PAHs含量的方法大多依賴于測定其他介質中PAHs的分析方法[11-13]。植物葉片，尤其是針葉樹種如油松葉片，含有大量的脂類、蠟質和色素，已有方法很難消除這些成分的干擾。因此，建立通用和準確測定樹葉中PAHs的分析方法很有必要。本文采用索氏提取，硅膠柱和凝膠柱雙凈化的前處理方式，以GC-MS對常見樹種葉片中痕量多環芳烴進行分析檢測。由于萘的實驗背景值較高，且揮發性強、易降解，在環境中有很大的不確定性，所以本文對萘未作探討。

1　實驗部分

1.1儀器與試劑

氣相色譜-質譜聯用儀(美國Agilent，7890A GC-日本電子JMS-Q1000)；RE-52AA旋轉蒸發儀(日本EYELA)；SE812氮吹儀(北京帥恩科技有限責任公司 )；Tube Mill control研磨機(德國IKA公司)；自制直徑為15 mm×30 cm的層析柱以及直徑為25 mm ×30 cm帶沙板的層析柱。正己烷、二氯甲烷、丙酮、無水硫酸鈉、層析用硅膠(0.63～0.1 mm)、層析用凝膠(200～400目)均為分析純。

PAHs進樣標：苯并(a) 蒽-D12溶液(溶劑為壬烷)，濃度為10 μg/mL，用正己烷稀釋成1 μg/mL作為工作溶液，上機測試前加入，用于跟蹤樣品前處理、分析過程的回收率。

PAHs凈化標：苊烯-d10、菲-d10、熒蒽-d10、芘-d10、苯并(a) 芘-d12、苯并(g,h,i) 苝-d12混合溶液(溶劑為壬烷)，濃度均為10 μg/mL，用正己烷稀釋至1 μg/mL作為工作溶液，樣品萃取前加入，用于GC-MS的定量分析。

1.2實驗方法

1.2.1樣品的提取稱取5 g植物粉末加入玻璃纖維濾筒中，添加50 μL濃度為1 μg/mL的PAHs凈化標后，將濾筒放入索氏提取器中，用200 mL正己烷-二氯甲烷混合溶液(1∶1)以每小時回流不少于4次的速度連續提取16～24 h。提取完成后，將提取液旋轉蒸發濃縮，在45 ℃以下濃縮至1～2 mL，加入10 mL正己烷繼續旋蒸，將溶劑完全轉為正己烷，濃縮至1 mL左右，待凈化。

1.2.2樣品的凈化手填硅膠柱：在層析柱(直徑15 mm ×30 cm)底部墊石英棉，用10 mL正己烷沖洗內壁，濕法裝柱，從下至上依次填充活化硅膠10 g和無水硫酸鈉6 g，用60 mL正己烷淋洗硅膠柱。將濃縮好的樣品轉移至硅膠柱上。用25 mL正己烷洗脫，棄去洗脫液；再用80 mL正己烷-二氯甲烷混合溶液(4∶1)洗脫，收集洗脫液，整個洗脫過程淋洗速度為1滴/s。將洗脫液旋轉蒸發濃縮至3 mL以下，準備下一步處理。

GPC柱：溶劑為正己烷-二氯甲烷混合溶液(1∶1)，使用自帶沙板直徑為25 mm×30 cm的層析柱。將清洗好的凝膠裝填到層析柱中，裝填高度為20 cm，用100 mL混合溶劑淋洗GPC柱。將濃縮好的樣品轉移到GPC柱上，用50 mL混合溶劑洗脫，棄去洗脫液；再用100 mL混合溶劑洗脫，收集洗脫液。將洗脫液旋轉蒸發濃縮至約1～2 mL，轉移到氮吹管中氮吹至0.5 mL，在最終樣品中加入50 μL 濃度為1 μg/mL的PAHs進樣標，渦旋混勻后，待測。

1.2.3儀器條件氣相色譜條件：使用DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm) 毛細管柱，初始溫度為50 ℃，保持2 min，以20 ℃/min升至200 ℃，保留2 min，再以4.5 ℃/min升至240 ℃，保留2 min，最后以2.5 ℃/min升至290 ℃，保留2 min。進樣口溫度為280 ℃，載氣為高純氦氣(純度99.999%)。進樣體積1.0 μL，不分流進樣。

質譜條件：EI 源，電子能量70 eV，傳輸線溫度270 ℃，離子源溫度250 ℃，檢測器電壓：-1 300 V，離子化電流：100 μA，掃描方式為選擇離子監測(SIM)。

2　結果與討論

2.1凈化方法的優化

PAHs的凈化方法一般有硅膠柱凈化或硅膠和弗羅里硅土按照一定比例裝填的層析柱凈化，但均為一步凈化。由于PAHs是半揮發性污染物，植物樣品中PAHs的含量遠遠小于環境樣品中的PAHs含量，但植物樣品中含有大量色素和少量油脂雜質會干擾樣品的測定，因此必須優化凈化方法，盡可能完全去除雜質，以滿足分析要求。本方法選擇兩步凈化——硅膠柱凈化和GPC凈化。

硅膠是分析PAHs最適合的固相萃取吸附劑，應用硅膠柱凈化樣品中PAHs具有分離性能穩定、淋洗液用量少、凈化效果明顯等特點[14]。常用的1 g硅膠柱適用于土壤、沉積物等，但植物葉片含有大量的脂類和蠟質，易堵塞柱子。本文采用手填式硅膠(10 g)柱，既不易堵柱又具有一定的凈化效果。但僅過硅膠柱，洗脫液為橙色且黏稠，不符合檢測條件。

為使樣品凈化徹底，采用手填式凝膠(10 g)柱進一步滲透凈化[15]。GPC柱能夠將硅膠凈化后剩余的油脂和色素完全除去，得到無色透明的洗脫液。因此，依次過硅膠柱和凝膠柱可使樣品充分凈化，得到可靠性強的測試結果。

2.2標準曲線的繪制

采用內標法定量，配制不同濃度的標準溶液(10，20，50,100,250,500,1 000 ng/mL)，各濃度點均相應的含凈化標和進樣標各100 ng/mL。用標準物質與相應內標物質的峰面積之比(y)和標準溶液中標準物質與內標物質的濃度比(x)制作標準曲線，結果見表1。15種多環芳烴在10～1 000 ng/mL范圍內線性良好，儀器檢出限(IDL)和定量下限(IQL)分別為1.07～3.26 ng/mL和4.27～13.1 ng/mL。圖1為多環芳烴的總離子流色譜圖。

表1　15種PAHs的線性方程、相關系數(r)、儀器檢出限(IDL)和定量下限(IQL)Table 1　Regression equations，correlation coefficients(r)，instrument detection limits and quantitation limits of 15 PAHs

圖1　標準溶液中15種PAHs的總離子流色譜圖Fig.1　Total ion chromatogram of 16 PAHs standard solution the number(1-15) denoted was the same as that in Table 1

2.3精密度與準確度

在玻璃纖維濾紙中加入25 μL PAHs標準溶液(1 μg/mL)作為空白加標樣品，按照本方法平行測定3次，計算目標物濃度平均值、回收率和相對標準偏差(RSD)(表2)。結果表明，標樣溶液的加標回收率為82.2%～130%，RSD均為0.58%～11%。

使用植物葉片基質加標樣品進行精密度和準確度實驗，更能反映方法的性能。以實際樹種紫葉李(Prunuscerasifera)葉片樣品作為空白，葉片樣品中加入250 μL PAHs標準溶液(1 μg/mL)作為葉片加標樣品，按照本方法平行測定3次，結果見表2。結果表明，各化合物的加標回收率為46.7%～132%，RSD為2.4%～15%。與空白加標實驗相比，葉片基質加標樣品中PAHs的回收率范圍變大，相對標準偏差較大。這些差異主要是因為低環PAHs屬于易揮發的環境有機污染物，尤其是苊烯、苊、芴、菲、熒蒽以及芘在空白樣品中均有檢出，存在著不確定性。此外，實驗發現葉片基質對分析物的基質效應既有增強，也有抑制。但所得結果與針對其他介質中PAHs的研究相近[10，16-17]，在環境痕量分析可接受范圍內[18]。

表2　空白及葉片樣品中15種PAHs的加標回收率及相對標準偏差(n=3)Table 2　Recoveries and RSDs of 15 PAHs in blank and leaf samples(n=3)

*to deduct the value of the blank(為扣除空白的值),**to deduct the content of PAHs in plant leaves(為扣除植物葉片中PAHs的含量)

2.4方法檢出限與定量下限

在5 g石英砂中加入5 μL PAHs標準溶液(1 μg/mL)，共6份平行加標樣品，按照本文前處理過程進行分析，獲得6個平行樣品中PAHs濃度，計算其標準偏差(SD)，查找t值，并計算方法檢出限MDL=t×SD，方法定量下限MQL=4 MDL，結果見表3。結果表明，方法檢出限(MDL)和定量下限(MQL)分別為0.025 1～5.80 ng/g和0.101～23.2 ng/g。由于低環PAHs的背景較高，所以方法檢出限偏高。

表3　15種PAHs的方法檢出限及定量下限Table 3　The method detection limits and quantitation limits for 15 PAHs

2.5實際樣品檢測

采用本方法對采自北京市西直門北大街的圓柏(Sabinachinensis)、紫葉李(Prunuscerasifera)、油松(Pinustabuliformis)和毛白楊(Populustomentosa) 4種植物葉片樣品中的15種多環芳烴進行檢測。準確稱取5 g植物葉片樣品(干樣品)，按照上述優化方法進行前處理，上機測定，結果見表4。15種PAHs的總含量為 509.58～1 476.54 ng/g，其中4種樹種葉片中總PAHs的含量依次為圓柏>紫葉李>油松>毛白楊，這可能與植物葉面結構[19]和葉脂含量[12]有關。

表4　實際樣品中PAHs含量的測定結果(ng/g，干樣品)Table 4　Determination results of PAHs(ng/g，dry sample) in different tree species leaves

BDL：below detection limit

3　結　論

本文建立了植物葉片樣品中痕量多環芳烴的測定方法。該方法可有效去除雜質，定量準確，適用于常見樹種葉片樣品中15種PAHs的測定，為今后大批植物樹種葉片中PAHs的測定提供了參考，具有一定的應用價值。

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Determination of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons(PAHs) in Plant Leaf Samples by Silica Gel Column and Gel Column Purification/Gas Chromatography-Mass Spectrometry

BAO Fen-qiang1，AN Hai-long2，HUI Ya-mei3，ZHANG Xiang-xue1*，XIA Xin-li2*

(1.College of Sciences，Beijing Forestry University，Beijing100083，China;2.National Engineering Laboratory for Tree Breeding，Beijing Forestry University，Beijing100083，China;3.CSD IDEA(Beijng) Environmental Test and Analysis Co.，Ltd.，Beijing100192，China)

A method was developed for the analysis of polycyclic aromatic hydrocarbons(PAHs) in plant leaves by gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS) based on silica gel column and gel permeation chromatography(GPC) purification.The target analytes in leaf samples were extracted with dichloromethane-hexane(1∶1，by volume) solution，purified with silica gel column and GPC column，analyzed by GC-MS，and then quantified by the internal standard method.The average recoveries of 15 PAHs were in the range of 82.2%-130% with relative standard deviations(RSD) not more than 11%.The detection limit(LOD) of this method varied from 0.025 1 ng·g-1to 5.80 ng·g-1.This method could effectively remove the pigment and oil in the plant leaves，suitable for the trace analysis of PAHs in leaf samples，and providing a technical support for the determination of content of PAHs in the plant tissues.

soxhlet extraction;silica gel column;gel permeation chromatography(GPC);polycyclic aromatic hydrocarbons(PAHs);gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS)；plant

2016-02-16；

2016-03-21

林業公益性行業科研專項(201304301)

張祥雪，教授，研究方向：生物物理，Tel：010-62338136，E-mail：zxx@bjfu.edu.cn

夏新莉，教授，研究方向：植物抗逆生理學，Tel：010-62336400，E-mail：xiaxl@bjfu.edu.cn

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.09.021

O657.63；O625.15

A

1004-4957(2016)09-1185-06