核磁共振法測定依帕列凈含量

孫林林，張芬芬，沈文斌，丁　婭*

(1.中國藥科大學　藥物分析教研室，江蘇　南京　210009 ；2.東華大學　分析測試中心，上海　201620；3.中國藥科大學　藥物科學研究院，江蘇　南京　210009)

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核磁共振法測定依帕列凈含量

孫林林1，張芬芬2，沈文斌3*，丁婭1*

(1.中國藥科大學藥物分析教研室，江蘇南京210009 ；2.東華大學分析測試中心，上海201620；3.中國藥科大學藥物科學研究院，江蘇南京210009)

分別以鹽酸吉西他濱和齊多夫定為內標，采用定量核磁共振法對依帕列凈含量進行測定。以氘代二甲亞砜和重水混合液為溶劑，確定氫定量核磁共振方法(1H-qNMR)的測試條件為：激發脈沖角度30°；時間域數據點32 K；測定溫度303 K；脈沖延遲時間20 s；采樣次數32；窗函數0.3 Hz。在此實驗條件下，結果專屬性良好，穩定性可達24 h，耐用性符合要求。以樣品與內標的峰面積比對其摩爾比繪制標準曲線，結果顯示，依帕列凈與內標鹽酸吉西他濱的摩爾比在0.512 5～1.953 8范圍內，依帕列凈與內標齊多夫定的摩爾比在0.494 7～1.966 0范圍內線性關系良好，相關系數(r2)均為0.999 9。以鹽酸吉西他濱和齊多夫定為內標時,依帕列凈的含量測定結果分別為99.83%和99.77%，相對標準偏差(RSD)分別為0.06%和0.19%。2種內標方法的測定結果一致，所建立的方法專屬、準確、簡便、快捷，適用于新藥的含量測定。

依帕列凈；定量核磁共振；鹽酸吉西他濱；齊多夫定

依帕列凈(Empagliflozin)是由勃林格殷格翰(Boehringer Ingelheim)公司開發的一種新型選擇性鈉-葡萄糖協同轉運蛋白2(SGLT2)抑制劑，商品名為Jardiance，于2014年8月1日由美國FDA批準上市，用于改善2型糖尿病(T2DM)患者的血糖控制。SGLT2表達于腎臟近端小管，負責腎小管內大部分葡萄糖的重吸收。依帕列凈通過抑制SGLT2減少葡萄糖的重吸收，降低腎糖閾，增加尿糖的排泄[1-2]。此外，依帕列凈還可降低體重[3]，適度降血壓，可用于同時患有T2DM和高血壓的病人[4]。由于降糖機制不同，依帕列凈作為SGLT2抑制劑可與其他常用類型的降糖藥聯合應用,如吡格列酮(Pioglitazone)[5]、二甲雙胍(Metformin)[6]等。由于依帕列凈是一種新型藥物，各國藥典均未收錄，尚無法確定對照品。在實際藥品檢驗工作中，準確快速測定依帕列凈的含量對于藥品的質量控制有著非常重要的意義，因此需要制備工作對照品，并對其含量進行測定。

定量核磁共振(Quantitative nuclear magnetic resonance，qNMR)技術不需要待測物對照品，僅以已知含量的藥物或化學物質為參比即可對其進行含量測定[7]，樣品前處理步驟簡便、快捷，可顯著提高檢測效率，已先后被美國藥典、英國藥典[8]、歐洲藥典、中國藥典 2010 版收錄[9]。近年來，qNMR技術在藥品含量測定領域的應用越來越廣泛，主要包括藥物對照品、原料藥、藥物制劑的含量測定等。目前，qNMR 包括1H,13C,19F,31P,14N,15N-NMR等，定量方法主要包括相對定量法和絕對定量法，其中絕對定量法又分為內標法、外標法和標準添加法。由于1H 核磁共振定量技術靈敏度高，適用范圍廣，國內外已有大量研究報道[10-16]。

本研究采用齊多夫定和鹽酸吉西他濱兩種內標，以氘代二甲亞砜和重水混合為溶劑，分別建立了qNMR定量測定依帕列凈含量的方法，考察了實驗條件的影響，對所建立的方法進行驗證，并應用于依帕列凈供試品的含量測定。

1　實驗部分

1.1儀器與試劑

Avance-300型超導核磁共振儀及Topspin 2.1操作軟件(瑞士Bruker公司)；BT125D分析用電子天平(感量0.01 mg，德國 Sartorius公司)。

依帕列凈(江蘇柯菲平醫藥科技有限公司，批號140202)；鹽酸吉西他濱(含量99.8%，中國藥品生物制品檢定所，批號100622-201202)；齊多夫定(含量100.0%，中國藥品生物制品檢定所，批號100672-200401)；氘代二甲亞砜(99.9 atom% D，DMSO-d6,Sigma-Aldrich公司)，重水(99.9 atom% D，D2O,Sigma-Aldrich公司)。

1.2實驗方法

1.2.1供試品溶液的制備分別精密稱取依帕列凈供試品約15.0 mg及內標鹽酸吉西他濱10.0 mg置于同一離心管中，加入0.5 mL氘代二甲亞砜(DMSO-d6)和0.1 mL D2O溶液，振蕩溶解，平行制備3份，轉移至直徑為5 mm的樣品管中待測；分別精密稱取依帕列凈供試品約15.0 mg及內標齊多夫定8.9 mg置于同一離心管中，加入0.4 mL DMSO-d6和0.25 mL D2O，振蕩溶解，平行制備3份，轉移至直徑為5 mm的樣品管中待測。

1.2.2核磁共振定量實驗條件激發脈沖角度30°；時間域數據點32 K；測定溫度303 K；脈沖延遲時間20 s；采樣次數32；窗函數0.3 Hz；掃描寬度3 840 Hz，中心頻率1 710 Hz。圖譜處理時，均采用手動方式依次進行相位校正、基線校正和化學位移校正，并根據所選的定量峰及積分范圍進行積分。

2　結果與討論

2.1樣品制備方法及氘代溶劑的選擇

合適的溶劑首先應滿足對樣品和內標均有良好的溶解度，考慮到待測物及內標的溶解性,選擇氘代二甲亞砜為溶劑，同時加入不同比例的重水以消除活潑質子的干擾。當內標為鹽酸吉西他濱時，選擇0.5 mL DMSO-d6和0.1 mL D2O混合為溶劑；而內標為齊多夫定時，由于依帕列凈δ4.91附近的活潑質子在常用的混合溶劑系統(0.4 mL DMSO-d6和0.1 mL D2O混合或0.5 mL DMSO-d6和0.1 mL D2O混合)中很難交換完全，需加大D2O量使其盡可能交換完全,因此最終選擇0.4 mL DMSO-d6和0.25 mL D2O混合為溶劑。由于DMSO-d6和D2O的粘度較大且內標液轉移可能帶來較大誤差，因此采用直接稱量樣品與內標配樣。

2.2內標物的選擇

合適的內標應滿足能與待測樣品同時溶于溶劑系統，并使參考峰與樣品峰分離，以及不與待測樣品相互作用等。根據依帕列凈的氫譜(圖1A)，選擇在7.5～8.5 ppm或4.7～6.5 ppm出現信號的物質作為內標物。根據本實驗室已有研究，分別以鹽酸吉西他濱和齊多夫定作為內標物測定其氫譜(圖1B和C)。由兩圖可知，鹽酸吉西他濱和齊多夫定均有符合條件的信號可用作定量峰；且兩者的分子量與依帕列凈分子量接近，可減少稱量誤差。因此最終選用鹽酸吉西他濱和齊多夫定作為內標物。

圖1　待測物及內標物的1H NMR圖Fig.1　1H NMR spectra of analyte and the interral standardsA.empagliflozin,B.gemcitabine hydrochloride,C.zidovudine,D.mixture of empagliflozin and gemcitabine hydrochloride,E.mixture of empagliflozin and zidovudine；marked signals were selected for quantitative analysis

2.3定量峰的選擇

定量峰首先應滿足在選定的積分范圍內無干擾，在此基礎上應選擇性質相近的信號峰，當有多個信號峰符合條件時，取其平均值，以減少誤差。依帕列凈和鹽酸吉西他濱混合后的氫譜見圖1D，δ6.78和δ4.91處的信號峰相對獨立，與鹽酸吉西他濱內標峰(δ8.08，δ6.16，δ6.06)無重合，因此選定δ6.78(2H，d)和δ4.91(1H，t)為依帕列凈的定量峰，δ8.08(1H，d),δ6.16(1H，d)和δ6.06(1H，t)為內標鹽酸吉西他濱的定量峰。依帕列凈和齊多夫定混合后的氫譜見圖1E，以齊多夫定為內標時，依帕列凈δ4.91附近的活潑質子很難完全交換，因此選定δ6.74(2H，d)為依帕列凈的定量峰，δ7.75(1H，s),δ6.15(1H，t)為內標齊多夫定的定量峰。

2.4定量核磁共振參數的選擇

2.4.1脈沖延遲時間(d1)的選擇 共振峰面積與該共振峰的質子數成正比是核磁共振定量的基礎，而保證這一基礎的前提是使自旋核達到完全弛豫。當d1≥5T1(縱向弛豫時間)時，才可保障99%以上的自旋核達到完全弛豫[13]。分別設置d1為2，5，10，20，40 s進行測定，結果顯示，當d1≥10 s時，樣品定量峰以及樣品與內標定量峰面積比值無明顯變化，因此最終選定延遲時間(d1)為20 s。

2.4.2采樣次數的選擇圖譜的信噪比與采樣次數的平方根成正比，核磁共振定量一般要求S/N≥250。分別考察采樣次數為2，4，8，16，32，64次的圖譜信噪比，結果表明，當采樣次數為16，32和64次時，儀器信噪比均滿足定量要求。為了取得較高的信噪比并節省檢測時間，最終選擇采樣次數為32次。

2.5方法學驗證

2.5.1專屬性依帕列凈供試品、內標鹽酸吉西他濱標準品、齊多夫定標準品，以及內標分別與依帕列凈混合溶液的核磁共振氫譜見圖1。結果表明混合溶液中樣品與內標各定量峰能夠完全分離，無雜質及相互間干擾。

2.5.2線性及范圍分別精密稱取樣品約30.0，22.6，15.0，10.0，7.5 mg，內標齊多夫定9.0 mg或內標鹽酸吉西他濱10.0 mg，置于同一離心管中，按“1.2.1”方法平行配制5份樣品溶液，按“1.2.2”條件進行測定。以(樣品/內標)的摩爾比為橫坐標(x)，定量峰面積比為縱坐標(y)進行線性擬合。結果顯示，以鹽酸吉西他濱和齊多夫定為內標時，樣品與內標鹽酸吉西他濱和齊多夫定的摩爾比分別在0.512 5～1.953 8和0.494 7～1.966 0范圍內，氫信號與樣品稱樣量成正比，回歸方程分別為y=0.009x-0.003和y=0.576x+0.026，相關系數(r2)均為0.999 9。表明所建立的核磁共振定量法線性關系良好。

2.5.3精密度精密稱取適量樣品和內標，按“1.2.2”測定條件分別在日內和日間做6組測試。結果顯示，依帕列凈與內標鹽酸吉西他濱峰面積(NRAS/NSAR) 的日內相對標準偏差(RSD)為0.19%，日間RSD為0.28%；依帕列凈與內標齊多夫定峰面積(NRAS/NSAR) 的日內RSD為0.31%，日間RSD為0.34%，方法的精密度良好。

2.5.4耐用性考察了采樣次數(ns=24～40)、溫度(T=298～308 K)及內標用量(IS±1 mg)變化對實驗結果的影響。結果表明，以鹽酸吉西他濱和齊多夫定為內標時，采樣次數、溫度和內標量的微小變化對測定結果的影響均較小，表明該法的耐用性良好。

2.5.5穩定性取同一供試品溶液分別在 0，2，4，8，12，18，24 h 進樣測定，結果顯示，依帕列凈樣品與內標鹽酸吉西他濱以及齊多夫定峰面積比值的RSD(n=7)分別為0.06%和0.16%，表明供試品溶液室溫放置 24 h 內穩定。

2.6樣品測定

結果顯示，以鹽酸吉西他濱為內標測得依帕列凈供試品的含量為99.83%(n=3，RSD=0.06%)；以齊多夫定為內標測得依帕列凈供試品的含量為99.77%(n=3，RSD=0.19%)，兩種內標所測結果一致，表明該方法結果準確、可靠。

表1　依帕列凈(YPLJ)的含量測定結果Table 1　Absolute content of empagliflozin

3　結　論

本研究采用鹽酸吉西他濱和齊多夫定2種內標，以氘代二甲亞砜和重水混合液為溶劑，選取合適的1H-qNMR測試條件和定量峰，對依帕列凈供試品進行含量測定。結果顯示，2種內標所測結果一致，所建立的方法操作簡便、特異性強、快速準確，為依帕列凈原料藥的含量測定提供了一種新手段，有望為其質量控制研究提供實驗依據。

[1]Malla P，Kumar R，Mahapatra M K，Kumar M.Med.Res.Rev.，2014，34(6)：1146-1167.

[2]Zhao X，Cui Y M，Zhao S，Lang B，Broedl U C，Salsali A，Pinnetti S，Macha S.Clin.Ther.，2015，37(7)：1493-1502.

[3]Michel M C，Mayoux E，Vallon V.Naunyn-Schmiedeberg'sArch.Pharmacol.，2015，388(8):801-816.

[4]Tikkanen I，Narko K，Zeller C，Green A，Salsali A，Broedl U C，Woerle H J，Bajaj H S.Can.J.Diabetes，2013，37(S4):S30.

[5]Kovacs C S，Seshiah V，Merker L，Christiansen A V，Roux F，Salsali A，Kim G，Stella P，Woerle H J，Broedl U C.Clin.Ther.，2015，37(8):1773-1788e1.

[6]Haering H U，Merker L，Christiansen A V，Roux F，Salsali A，Kim G，Meinicke T，Woerle H J，Broedl U C.DiabetesRes.Clin.Pract.，2015，110(1)：82-90.

[7]Chen X L，Guo Y J，Hu Y J，Yu B Y，Qi J.J.Pharm.Biomed.Anal.，2016，124 ：281-287.

[8]Holzgrabe U，Deubner R，Schollmayer C，Waibel B.J.Pharm.Biomed.Anal.，2005，38(5)：806-812.

[9]National Pharmacopoeia Committee.ThePharmacopoeiaofthePeople'sRepublicofChina(Part Ⅱ，2010 Ed．).Beijing:China Medical Science Press(國家藥典委員會.中華人民共和國藥典.二部.北京：中國醫藥科技出版社)，2010：81-83.

[10]Jiang M H，Yu X B，Mao L S，Shen W B，Di B.J.Chin.Pharm.Univ.(蔣孟虹，于小波，毛黎順，沈文斌，狄斌．中國藥科大學學報)，2013，44(4)：339-342.

[11]Holzgrabe U.Prog.Nucl.Magn.Reson.Spectrosc.，2010，57(2)：229-240.

[12]Guo Q S，Shi G Q，Song W，Xu X.J.Instrum.Anal.(郭強勝，石高旗，宋巍，許旭.分析測試學報)，2012，31(1)：117-120.

[13]Bharti S K，Roy R.TrendAnal.Chem.，2012，35：5-26.

[14]Zhang F F，Jiang M H，Shen W B，Ding Y.J.NanjingNorm.Univ.:Eng.Technol.Ed.(張芬芬，蔣孟虹，沈文斌，丁婭．南京師范大學學報:工程技術版)，2014，14(2):8-18.

[15]Kuchta K，Ortwein J，Hennig L，Rauwald H W.Fitoterapia，2014，96(12)：8-17.

[16]Hu M F，Jiang M，Qiu H，Wang L J，Wei Q.J.Instrum.Anal.(胡敏芳，江明，邱慧，王玲娟，魏強.分析測試學報)，2013，32(12)：1511-1514.

Quantitative Determination of Empagliflozin by Nuclear Magnetic Resonance

SUN Lin-lin1，ZHANG Fen-fen2，SHEN Wen-bin3*，DING Ya1*

(1.Department of Pharmaceutical Analysis，China Pharmaceutical University，Nanjing210009，China;2．Analysis and Testing Center，Donghua University，Shanghai201620，China;3.Pharmaceutical Research Institute，China Pharmaceutical University，Nanjing210009，China)

A method was established to determine the content of empagliflozin by1H nuclear magnetic resonance spectroscopy(1H-NMR)，using gemcitabine hydrochloride and zidovudine as the internal standard，repectively.NMR spectra were recorded using a standard 1D pulse sequence at a 30° flip angle and with DMSO-d6-D2O as the solvent.Thirty two scans of 32 K data points were acquired at a temperature of 303 K，a relaxation delay of 20 s and a line broad of 0.3 Hz.Under the optimal conditions，method validation indicated specificity，robustness and stability up to 24 h.A good linear relationship was obtained between peak area ratio and molar ratio of empagliflozin to the internal standard.For gemcitabine，the regression equation wasy=0.009x-0.003(r2=0.999 9) with a molar ratio range of 0.512 5-1.953 8.For zidovudine，the regression equation wasy=0.576x-0.026(r2=0.999 9) with a molar ratio range of 0.494 7-1.966 0.The contents of empagliflozin were 99.83%(n=3，RSD=0.06%)and 99.77%(n=3，RSD=0.19%)corresponding to the internal standards gemcitabine hydrochloride and zidovudine，respectively.The results were consistent with each other，indicating that the method had the advantages of accuracy，high sensitivity and good repeatability，and could be used for the quantification of new drugs.

empagliflozin；quantitative NMR；gemcitabine hydrochloride；zidovudine

2016-03-01；

2016-03-22

沈文斌，副研究員，研究方向：核磁共振，Tel:025-83271233，E-mail：cpunmrswb@163.com

丁婭，博士，副教授，研究方向：納米藥物分析及有機光譜分析，Tel:025-83271326，E-mail：ayanju@163.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.09.015

O482.532；TQ460.72

A

1004-4957(2016)09-1157-05