濕加松組織培養快繁技術的研究

朱尾銀

（福建林業科技試驗中心，福建漳州363600）

濕加松組織培養快繁技術的研究

朱尾銀

（福建林業科技試驗中心，福建漳州363600）

以半木質化穗條莖段為外植體，開展濕加松組培快繁關鍵技術對比試驗，探討不同的外植體消毒方法、培養基類型、植物激素對芽的誘導、增殖、分化和生根的影響。結果表明：滅菌凈浸泡8min+75%乙醇消毒10 s+含吐溫-20的0.1%HgCl2消毒8min，或滅菌凈浸泡8min+75%乙醇消毒15 s+含吐溫-20的0.1%HgCl2消毒6 min，消毒效果最佳；改良MS+0.5mg·L-16-BA+0.8mg·L-1ZT+0.3mg·L-1IBA是最優的繼代增殖培養基，增殖倍數3.2，基部長出的叢生芽健壯，生長力強。以1/2改良MS為生根培養的基本培養基，添加的生長素濃度組合以0.8mg·L-1IBA+0.1mg·L-1NAA為最佳，生根率可達36.7%。

濕加松；組織培養；基本培養基；激素；生根率

濕加松（Pinus elliottii×Pinus oaribaea）又名濕加雜交松，澳大利亞研究選育出的優良品種，由濕地松與洪都拉斯加勒比松互為父母本的雜交后代［1-3］再經雜交而成的二代雜交品種，綜合了雙親的優點，雜種優勢極其明顯，樹形圓滿通直，木材纖維長度和基本密度在二個親本之間，耐水濕能力、抗風與抗病蟲害能力強，生長迅速，適應范圍廣［4-5］，產脂量也遠遠高于親本和馬尾松，是一個速生、豐產、優質的優良樹種，極具推廣價值［6-7］。濕加松以全新的松屬中的一員進入中國的市場，對它的研究較少［8-9］。為保持其優良基因型，濕加松主要采用無性繁殖方式進行種苗生產。組織培養是迅速擴大種苗生產規模的重要途徑。目前，濕加松組織培養快繁技術研究取得一定進展，但還存在增殖系數低、胚狀體發生頻率低、生根困難等問題［10-13］，提高了組培苗生產成本，嚴重限制了組培技術在現階段的應用［14］。本研究以半木質化穗條莖段為外植體，開展濕加松組培快繁關鍵技術對比試驗，探討不同的外植體消毒方法、培養基類型、植物激素對芽的誘導、增殖、分化和生根的影響，提高叢生芽的增殖系數、生根率，對完善濕加松組培快繁技術，解決濕加松的種苗規模化生產的瓶頸問題，促進濕加松在林業上的推廣應用，具有重要意義。

1　材料與方法

1.1試驗材料來源

從福建省林業科技試驗中心五板橋試驗基地濕加松采穗圃選取生長健壯、無病蟲害的嫩芽莖段作為外植體。濕加松采穗圃建于2007年。

1.2材料處理與培養條件

從采穗圃采回的幼嫩枝條，用自來水沖洗15min后用洗衣粉浸泡10min，再用自來水沖洗30min。在超凈工作臺上切成2.0～2.5 cm長的具潛伏芽的莖段，用無菌水沖洗一次，置工作臺上進行不同消毒措施對比試驗。繼代培養基對比試驗、激素濃度和組合對比試驗、生長素濃度對比試驗均使用誘導的無菌材料進行接種。培養室溫度控制在（24±2）℃，光強為2 000～3 000 Lx，光照時間為12 h·d-1。

1.3試驗設計

1.3.1外植體消毒方法的篩選

將濕加松中上部幼嫩莖段預處理后進行消毒處理，消毒程序依次為滅菌凈浸泡后用無菌水清洗3遍，接著75%乙醇消毒，然后再用含吐溫-20的0.1% HgCl2消毒，無菌水洗凈后接種。試驗采用滅菌凈（B）、75%乙醇（C）和含吐溫-20的0.1%HgCl2（D）3因子的3個消毒處理的時間梯度的正交L9（34）設計，共計9個組合（見表1），其中消毒時間梯度，B因子為0、5、8min；C因子水平為10、15、20 s；D因子水平為6、7、8 min。消毒完成后按正常接種程序，接種于MS+ZT（0.8mg·L-1）+IBA（0.2mg·L-1）誘導培養基上。每組接種50個，試驗重復3次。接種15 d后調查污染率，比較消毒效果，篩選最佳消毒方法。

1.3.2繼代培養基的選擇

將誘導的無菌材料分別接種于MS、改良MS、0.5MS、0.3MS、WPM、B5、SH培養基，各培養基里均添加ZT0.8 mg·L-1和IBA0.2 mg·L-1植物激素。各培養基同時接種50個，試驗重復3次。培養60 d后，觀察并記錄不定芽形成情況，計算芽的誘導率和芽的形成能力（感染細菌、死亡的接種徑段不參與統計）。

1.3.3激素濃度組合的篩選

濕加松增殖培養激素濃度組合的篩選，采用6-BA（0.3、0.5、0.8 mg·L-1）和ZT（0.5、0.8、1.2 mg·L-1）和IBA（0.1、0.2、0.3 mg·L-1）三因素三水平的正交L9（34）設計，共計9個組合，基本培養基為改良MS，每組接種50個，試驗重復3次。

1.3.4生根激素濃度的篩選

生根使用常規的IBA和NAA組合，采用隨機區組試驗設計，A因素為IBA（0.5、0.8、1.0 mg·L-1）和B因素NAA（0.05、0.1、0.2mg·L-1），共9個處理。基本培養基為1/2改良MS，試驗重復3次。將濕加松叢生芽中2～3 cm高的芽切割成單株，轉入生根培養基中進行不定根誘導，30 d后試驗結果調查，篩選最佳生根的激素濃度。

1.4數據處理

用SPSS統計軟件進行數據分析。不同外植體消毒方法下的無菌率、存活率情況統計結果和繼代培養基篩選試驗統計結果見表1，方差分析結果見表2、表3。激素濃度和組合篩選的試驗結果見表4，生根激素濃度篩選試驗結果見表5。

2　結果與分析

2.1不同消毒方法對濕加松外植體污染的影響

2.1.1無菌率的差異分析

從表1可以看出，不同消毒方法的無菌率差異極大，無菌率最低的是B1C1D1組合，最大的是B3C2D1，兩者相差62.0%。表2方差分析結果表明，B因素3水平間、C因素3水平間差異均具有高度統計學意義，D因素3水平間差異具有統計學意義，區組間差異不具有統計學意義。模型誤差具有高度統計學意義，B、C、D三因素間存在交互作用，各因素水平間的差異不能真正反映因素的主效，所以進行處理間多重比較，尋求最優水平組合。多重比較結果見表1。從表1可知，除B3C3D2與B3C1D3間、B2C2D3與B2C1D2間差異不具有統計學意義外，其它處理組合間均具有統計學意義。外植體消毒處理后的無菌率表現上，最優水平組合為

表2　外植體消毒試驗結果方差分析表

表3　不同基本培養基對比試驗結果方差分析

2.1.2保存率差異分析

從表1可以看出，不同消毒方法的保存率差異很大。組合B1C1D1、B1C2D2保存率最高，達到100%，組合B3C3D2的保存率最低，僅為78.0%。表2方差分析結果表明，表2方差分析結果表明，B因素3水平間、C因素3水平間差異均具有高度統計學意義，D因素3水平間差異具有統計學意義，區組間差異不具有統計學意義，模型誤差具有高度統計學意義。多重比較結果（表1）表明，B1C1D1、B1C2D2間，B1C3D3、B2C1D2、B2C3D1、B3C1D3間，B2C2D3、B3C2D1間差異不具有統計學意義，其它水平組合間差異具有統計學意義。從保存率上看，最優水平組合為B1C1D1、B1C2D2。

無菌率衡量的是對外植體上的細菌的滅殺效果，無菌率越高，說明滅菌效果越好，但也可能存在滅菌過度，從而殺死外植體。保存率指無感染的外植體中還存活著的外植體的比重，是衡量是否滅菌過度的一個重要指標。保存率低，說明該消毒措施在滅殺細菌的同時，對外植體也產生嚴重毒害作用。因此，兩指標必須綜合考慮。

2.1.3消毒效果差異分析

為了準確優選消毒方案，以無菌率與保存率的乘積（即消毒效果）來作為最終選擇的指標。從表1消毒效果統計數據可以看出，B3C1D3組合的消毒效果數據最高，達到0.76；B3C2D1組合的消毒效果次之；9個水平組合中，B1C1D1最低，僅為0.2。表2方差分析結果表明，B因素3水平間、C因素3水平間的消毒效果差異均具有高度統計學意義，D因素3水平間差異具有統計學意義，區組間差異不具有統計學意義，模型誤差具有高度統計學意義。表1中的多重比較結果表明，除B3C1D3與B3C2D1之間、B3C3D2與B2C3D1之間、B2C1D2與B2C3D1之間差異不具有統計學意義外，其他水平組合間均具有高度統計學意義或具有統計學意義。最優消毒效果的水平組合為B3C1D3、B3C2D1。

2.2濕加松繼代培養的基本培養基、激素濃度組合的篩選

2.2.1基本培養基對平均不定芽數和不定芽誘導頻率的影響

從表1基本培養基對比試驗結果可以看出，不同的基本培養基，在平均不定芽數、不定芽誘導頻律上，均存在明顯差異，其中，改良MS的平均不定芽數、不定芽誘導頻率均最高。接種于B5和SH培養基上的外植體，在相同的條件下幾乎不能出芽，外植體生長50 d后，出現發黃、頂端枯萎等現象，逐漸失去生長能力，直至死亡，如圖1（a），圖1（b）。而接種于其它培養基MS、0.5MS、0.3MS上的外植體雖有新芽長出，但相對于改良MS培養基上的外植體而言，誘導出的腋芽數量較少，同時生長也較慢。

圖1　在B5（a）和SH（b）培養基上生長情況

由于平均不定芽數屬于計數數據，不定芽誘導頻率數據小于70%，均標準化處理后參與方差分析。表3方差分析結果表明，基本培養基間在平均不定芽數、不定芽誘導頻率上，差異均具有高度統計學意義。表1多重比較結果表明，在平均不定芽數上，MS、0.3MS間差異不具有統計學意義，0.3MS、WPM、B5、SH間差異不具有統計學意義，其它均具有統計學意義。在不定芽誘導頻率上，除0.3MS、B5、SH間不具有統計學意義外，其它均存在具有統計學意義。改良MS培養基，在平均不定芽數、不定芽誘導頻率上，均顯著優于其它基本培養基。所以，選擇改良MS培養基為后續試驗的基本培養基。

不定芽形成能力，是不定芽誘導頻率與平均不定芽數的乘積，作為篩選基本培養基的重要指標，更具直觀性。表3方差分析結果表明，不同的基本培養基間，在不定芽形成能力上，差異具有高度統計學意義。表1中多重比較結果表明，改良MS的不定芽形成能力最好，與其他基本培養基間差異具有統計學意義，進一步驗證了改良MS是7種基本培養基中最適合濕加松繼代培養的培養基。

2.2.2激素濃度組合對濕加松增殖的影響

圖2　處理L5（a）、L7（b）和L9（c）的濕加松生長情況

表4　6-BA和ZT、IBA對濕加松增殖的影響

從表4可以看出，在改良MS中添加不同濃度組合的激素，增殖倍數差異較大，變動浮動為1.5～3.7，方差分析結果（表4）表明，6-BA不同濃度間、ZT不同濃度間的增殖倍數，差異均具有高度統計學意義，因此確定6-BA、ZT濃度，構成最優激素濃度組合，對提高組培效果，降低組培成本，具有重要意義。IBA不同濃度間差異不具有統計學意義。區組間差異不具有統計學意義，而模型誤差具有高度統計學意義，說明模型誤差主要來源于3種激素在不同濃度水平組合下的交互作用，應以3種激素的濃度水平組合進行多重比較，優選水平組合。多重比較結果見表4。除，L4、L7、L8之間，L1、L2、L3之間不具有統計學意義外，其它激素濃度組合間均具有統計學意義。L9與L8之間不具有統計學意義，增殖倍數最大，叢生芽多，但L9組合的叢生芽老葉容易變黃，芽高生長近乎停滯（見圖2C），L8組合的叢生芽卷曲、黃化，均生長狀況不正常，顯然不是最優組合；L5與L7、L8間增殖倍數不具有統計學意義，但L5的叢生芽從基部長出，芽粗壯，生長力強（圖2A），L7卻是基部長出緊縮的芽團。其它激素濃度組合的增殖倍數均與L5組合間存在具有統計學意義，且叢生芽生長力不如L5。因此，L5是最優激素濃度組合。

綜上所述，改良MS+0.5mg·L-16-BA+0.8mg·L-1ZT+ 0.3mg·L-1IBA是最適合濕加松的繼代增殖培養基。

表5　不同生長素濃度對濕加松生根的影響

2.3不同生長素濃度對濕加松生根的影響

由表5可知，以1/2改良MS為基本培養基進行濕加松生根誘導，隨著不同濃度的IBA、NAA加入，生根率及根特征有很大差異。為探討IBA、NAA對生根率的影響，進行雙因素方差分析，表5方差分析結果表明，不同的IBA濃度、NAA濃度的生根率差異，均具有高度統計學意義，IBA濃度×NAA濃度交互作用，差異具有統計學意義。在試驗設定的9個濃度組合中，F5、F8間生根率差異不具有統計學意義，為生根率最高的濃度組合，與其他濃度組合間均具有統計學意義。F8存在出根不整齊問題，F5出根整齊，根條健壯，所以，F5組合，即0.8 mg·L-1IBA+0.1mg·L-1NAA為本試驗最優生長素濃度組合。

3　結論與討論

濕加松幼嫩莖段為外植體進行的組織培養，最優消毒效果的水平組合為B3C1D3、B3C2D1，即滅菌凈浸泡8min后用無菌水清洗3遍，接著75%乙醇消毒10 s，然后再用含吐溫-20的0.1%HgCl2消毒8min，最后無菌水清洗干凈，或滅菌凈浸泡8min后用無菌水清洗3遍，接著75%乙醇消毒15 s，然后再用含吐溫-20的0.1%HgCl2消毒6 min，最后無菌水清洗干凈。改良MS培養基平均誘導不定芽個數2.9個，不定芽誘導頻率達到60.7%，不定芽形成能力為1.76，均具有統計學意義優于其它基本培養基；以改良MA為繼代培養的基本培養基時，激素濃度組合以0.5mg·L-16-BA+0.8 mg·L-1ZT+0.3 mg·L-1IBA為最佳，增殖倍數3.2，基部長出的叢生芽健壯，生長力強。以1/2改良MS為生根培養的基本培養基，添加的生長素濃度組合以0.8 mg·L-1IBA+0.1 mg·L-1NAA為最佳，生根率可達36.7%，根條正常、健壯，無愈傷化跡象。

（1）75%酒精配合0.1%升汞是比較常規的滅菌方法。75%酒精具有浸潤和滅菌的雙重作用，能滲入外植體內殺死病菌，但是對植物組織具毒害作用；0.1% HgCl2對植物組織也具較明顯的毒害作用。滅菌凈主要成分為三氯異氰脲酸（TCCA），有效氯含量達18%～21%，是一種強力、廣譜、高效的殺菌劑。它的使用可以大大減少菌的數量，提高殺菌的效果，對植物組織的破壞性不明顯。濕加松幼嫩莖段生長時間短，內生菌少，重點在于滅殺外植體表面細菌。用75%酒精配合0.1%升汞直接消毒，需要處理較長時間才能有效殺滅全部的外植體表面細菌，但同時會導致外植體內有機物溶解過多，部分細胞被毒害，所以即使消毒過關了，芽也難萌發或產生了畸形的芽［15］。從表2可以看出，在無菌率、保存率、消毒效果上，均存在滅菌凈F值＞75%乙醇F值＞0.1%升汞F值，說明在對無菌率、保存率、消毒效果的影響上，滅菌凈＞75%乙醇＞0.1%升汞。本試驗結果與馬蘭珍等［16］雜交松組織培養中外植體的滅菌方法的研究和常金財［18］濕加松無性系組培快繁技術研究結果一致。本試驗先用滅菌凈浸泡，降低75%乙醇消毒、0.1%HgCl2消毒時間，在達到滅菌效果的同時，較大幅度提高了保存率。

（2）濕加松對大量元素的比例要求比較苛刻，這是造成濕加松組培難的關鍵性問題。參試的MS、改良MS、0.5MS、0.3MS、WPM、B5、SH等7種培養基中，大量元素含量高的MS不適合，而大量元素比例相同而含量降低的0.5MS和0.3MS，以及木本植物常用的WPM、B5和SH培養基培養效果也不理想。改良MS培養基，突破了常規的MS大量元素比例，獲得了相對理想的繼代增殖效果。

（3）繼代增殖培養中，6-BA（0.5 mg·L-1）+ZT（0.8 mg·L-1）+IBA（0.3mg·L-1）為最佳激素水平。6-BA、ZT對增殖倍數的影響上，不同濃度水平間差異均具有高度統計學意義；F值6-BA（31.77）＞ZT（16.02），6-BA不同濃度對增殖倍數的影響大于ZT。IBA濃度對增殖倍數的影響不具有統計學意義，但由于模型誤差具有高度統計學意義，存在不同激素間的交互作用。本試驗中，交互作用可能存在于6-BA與ZT間，也可能存在于6-BA與IBA間，或ZT與IBA間，以及6-BA、ZT、IBA三者之間，因此，不能因IBA不同濃度水平間增殖倍數不具有統計學意義，忽略對IBA的濃度篩選。本試驗首次在濕加松增殖培養中引進了ZT，且發現最合適的濃度水平為0.8 mg·L-1。

（4）NAA、IBA對濕加松有明顯的促進生根作用，不同濃度對生根率的影響均具有高度統計學意義。方利娟［17］在NAA對雜交松試管苗伸長生長的影響研究中也發現，過高濃度的NAA則導致產生了大量的愈傷組織。本試驗中，當NAA濃度0.2 mg·L-1時，無論IBA濃度多少，均基部發生大量愈傷組織，甚至早期長出的根也完全再次愈傷化，與方利娟的研究結論吻合。試驗中IBA的F值（16.65）＞NAA的F值（9.47），IBA濃度對生根率的影響大于NAA。NAA、IBA不同濃度間的交互作用明顯，兩者搭配使用可望獲得更好的生根效果。

本試驗以濕加松半木質化穗條莖段為外植體，對濕加松的外植體消毒方法、繼代增殖培養基篩選，以及生根培養基添加的生長素濃度組合等進行了較為系統的研究，通過方差分析和多重比較，從試驗設計中篩選出最優的外植體消毒技術方案、繼代增殖培養基和0.5MS生根培養基的生長素濃度組合。經試驗優選的濕加松組培技術方案，外植體消毒效果≥0.74，繼代培養增殖倍數3.2，達到較為理想水平，但生根培養中生根率較低，僅36.7%，有待于進一步優化。

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（責任編輯：葉麗娜）

Study on Tissue Culture of Pinus elliottii×Pinus caribaea

ZHUWeiyin
（Fujian Forestry Science and Technology Test Center，Zhangzhou，Fujian 363600）

The best explantmaterial is the scion bud stem of half lignification，key technology was developed contrast for tissue culture of Pinus elliottii×Pinus caribaea.Through the different experiment of disifection method，medium type，plant hormone on the induction，proliferation，differentiation and rooting of shoots were studied with semi wood of scion stem segment explants of Pinus elliottii×Pinus caribaea.The results showed that the optimal disinfection method was 8 min for sterilizing net，10 s for 75%alcohol and 8 min for 0.1% HgCl2，or 8 min for sterilizing net，15 s for 75%alcohol and 6min for 0.1%HgCl2.Adventitious buds grew fast and proliferation multiple reached 3.2，when grown in themodified MS adding 0.5 mg·L-16-BA，0.8 mg·L-1ZT and 0.3 mg·L-1IBA.With 1/2 the modified MS added 0.8mg·L-1IBA and 0.1mg·L-1NAA，the rooting effectwas the best，and the rooting ratewas 36.7%.

Pinus elliottii×Pinus caribaea；tissue culture；basicmedium；hormone；rooting rate

S722.347

A

1674-2109（2016）06-0014-07

2016-04-13

朱尾銀（1979-），女，漢族，工程師，主要從事林木和花卉組培研究。