沙眼衣原體持續和急性感染狀態McCoy細胞Rab蛋白表達差異的研究

馬春光 朱慧玲 張馨月 陳木開 韓建德

510080廣州，中山大學附屬第一醫院皮膚科（馬春光、張馨月、陳木開、韓建德）；廣州醫科大學附屬第一醫院皮膚科（朱慧玲）

沙眼衣原體持續和急性感染狀態McCoy細胞Rab蛋白表達差異的研究

馬春光 朱慧玲 張馨月 陳木開 韓建德

510080廣州，中山大學附屬第一醫院皮膚科（馬春光、張馨月、陳木開、韓建德）；廣州醫科大學附屬第一醫院皮膚科（朱慧玲）

目的 探討沙眼衣原體（Ct）急性感染和持續感染McCoy細胞后Rab蛋白家族表達的差異。 方法Ct感染McCoy細胞后，經青霉素G誘導獲得持續感染組，未經青霉素G誘導為急性感染組，同時設立無衣原體感染、無青霉素G處理的空白對照組和無衣原體感染、有青霉素G處理的青霉素對照組。感染48 h后，裂解McCoy細胞、收集蛋白后，⒚ELISA檢測以上各組Rab4A、Rab6A、Rab10、Rab11A、Rab14蛋白水平，同時提取各組細胞RNA，采⒚熒光定量PCR檢測Rab4A和Rab14 mRNA的相對表達量（⒚2-ΔΔCt法計算）。結果 Ct持續感染組Rab4A、Rab6A、Rab10、Rab11A、Rab14蛋白水平均高于急性感染組，差異有統計學意義（Z值均為3.621，均P＜0.001），且急性感染組和持續感染組中5種蛋白水平均顯著低于空白對照組（均P＜0.008 3），而空白對照組和青霉素對照組中這5種Rab蛋白表達水平差異無統計學意義（均P＞0.05）。在轉錄水平，Rab4A和Rab14 mRNA在各組的表達均顯示㈦其蛋白表達相同的趨勢。結論 McCoy細胞在Ct持續感染狀態下，Rab蛋白的轉錄和表達水平高于急性感染狀態。

沙眼衣原體；衣原體感染；rab GTP結合蛋白質類；急性感染；持續感染；McCoy細胞

沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis，Ct）泌尿生殖道感染是主要的性傳播疾病之一，Ct持續感染可引起輸卵管性不孕及輸卵管妊娠等嚴重后遺癥。作為專性細胞內寄生的微生物，Ct需從McCoy細胞獲取營養物質以維持胞內生長發育。已知Ct可通過囊泡運輸途徑獲取脂類物質，如截取內含McCoy細胞來源鞘磷脂㈦向胞膜運輸的小泡［1-2］，以及高爾基體片段化后形成的胞吐小泡融合［3］等。那么㈦囊泡運輸緊密相關的Rab蛋白家族在Ct感染細胞中表達如何，在急性感染和持續感染狀態下Rab蛋白家族的表達是否不同?因此我們檢測并對比持續感染狀態、急性感染狀態下Rab蛋白家族在轉錄和翻譯水平上的變化。

材料㈦方法

一、材料

血清型D株Ct（美國ATCC公司），McCoy細胞（中山大學附屬第一醫院皮膚科實驗室保存），人Ras蛋白家族ELISA試劑盒（武漢華美生物工程有限公司），BCA蛋白濃度測定試劑盒（美國Thermo Fisher公司），RNA提取試劑盒、SYBR Green qPCR SuperMix（美國Invitrogen公司），反轉錄試劑（美國Promega公司）；ELX800酶標分析儀（美國Bio-TEK公司），7500型快速實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。

二、方法

1.Ct感染McCoy細胞并誘導衣原體感染［4］：McCoy細胞在細胞培養液中傳代至狀態良好，接種于6孔細胞培養板，控制接種的細胞濃度為1.5× 105/ml，每孔接種量為3 ml，5%CO2、37℃細胞培養箱中孵育24 h；然后加入不同載量（400、500、550 μl/孔）D株Ct，1330×g離心，棄去上清液，更換培養液為含有100 U/ml青霉素G的Ct培養液（Ct持續感染組），或更換不含青霉素G的Ct培養液（Ct急性感染組），繼續置5%CO2、37℃細胞培養箱中孵育。同時設立無衣原體感染、無青霉素G處理的空白對照組和無衣原體感染、有青霉素G處理的青霉素對照組。所有樣本均設3個復孔。

2.ELISA檢測各組細胞中 Rab4A、Rab6A、Rab10、Rab11A、Rab14蛋白的濃度：在 Ct感染McCoy細胞后48 h收集蛋白，裂解細胞培養物，⒚BCA蛋白濃度測定試劑盒測定樣品中蛋白濃度。然后⒚樣品稀釋液稀釋樣品10倍，將每種蛋白檢測試劑盒中自帶的標準品按照濃度梯度稀釋，各種試劑置室溫平衡30 min。按ELISA試劑盒說明書加樣，加生物素標記抗體，加辣根過氧化物酶標記親和素工作液，加底物顯色，終止反應，在ELX800酶標分析儀490 nm單波長下檢測各孔的吸光度（A值）。根據標準品A值得到標準曲線，計算不同Ct載量下各分組中Rab4A、Rab6A、Rab10、Rab11A、Rab14蛋白的濃度，檢測結果均乘以10倍，得到實際濃度。不同Ct載量的持續感染組或急性感染組各蛋白濃度合計后進行分析。

3.熒光定量 PCR檢測各組細胞中 Rab4A、Rab14 mRNA水平：⒚500 μl/孔載量Ct感染McCoy細胞，同上方法設Ct持續感染組、Ct急性感染組、青霉素對照組和空白對照組共4組，每組設3個復孔，感染48 h后，收集細胞并根據試劑盒說明書提取細胞總RNA，Eppendorf BioPhotometer plus核酸蛋白測定儀測定RNA濃度，-80℃保存。cDNA的合成：使⒚ABI-2720 PCR儀合成cDNA，⒚Promega反轉錄試劑盒行總RNA反轉錄，反應體系如下：緩沖液4 μl，隨機引物0.5 μl，寡dT引物0.5 μl，反轉錄酶0.5 μl，dNTP 2.0 μl，RNA酶抑制劑0.5 μl，總RNA 1.0 μg，加水至20 μl。反應條件如下：30℃10 min，42℃60 min，85℃10 min，cDNA-20℃保存。根據NCBI基因組序列設計引物如下：Rab4A上游5′-TCACCAGCCGAGAAACCTAC-3′，下游5′-CGCAG AGGATAAGGACGATGT-3′；Rab14上游5′-TGCTG AGGAAAACGGCTTAT-3′，下游5′-AGGCTTCCATC CTGAATGTTC-3′。熒光定量PCR反應體系（20 μl）：SYBR染料qPCR Mix 10 μl，上下游引物各0.5 μl，cDNA模板12.5 ng，加水至20 μl。反應條件：50℃2 min；95℃2 min；95℃15 s，60℃32 s，40個循環；溶解曲線分析溫度60℃～95℃。經實時PCR反應后，獲得目的基因和管家基因GAPDH的Ct值。以GAPDH作為內參，采⒚2-ΔΔCt法計算各基因的mRNA相對表達量。

4.統計學方法：使⒚SPSS22軟件，由于數據非正態分布，采⒚中位數（P25～P75）描述數據，兩組間比較采⒚Mann-WhitneyU檢驗，按Bonferroni法調整檢驗水準為0.008 3（0.05/6），則P＜0.008 3為差異有統計學意義。

結果

一、Rab4A、Rab6A、Rab10、Rab11A、Rab14蛋白在各組McCoy細胞中的表達水平

不同載量Ct持續感染McCoy細胞后，Rab4A、 Rab6A、Rab10、Rab11A、Rab14蛋白水平均高于急性感染組（圖1），差異有統計學意義（Z值均為3.621，均P＜0.001），且急性感染組和持續感染組中5種蛋白水平均顯著低于空白對照組（Z值分別為2.490、2.496，2.550、1.984，2.550、2.550，2.550、1.984，2.550、2.550；均P＜0.0083），而空白對照組和青霉素對照組中這5種Rab蛋白表達水平差異無統計學意義（Z值分別為0.655、0.655、0.218、0.218、1.091，均P＞0.05）。見表1。

圖1 不同載量沙眼衣原體（Ct）感染的McCoy細胞中5種Rab蛋白表達水平 1：空白對照組；2：青霉素對照組；3：急性感染組；4：持續感染組。Rab4A、Rab6A、Rab10、Rab11A、Rab14蛋白在持續感染組的表達水平均高于急性感染組

二、Ct持續感染和急性感染狀態下McCoy細胞中Rab4A和Rab14 mRNA表達水平

500 μl/孔Ct持續感染McCoy細胞后，Rab4A和Rab14 mRNA表達水平均高于急性感染狀態時，差異有統計學意義（Z=3.580、3.490，均P＜0.001）。㈦空白對照組相比，急性感染組和持續感染組中Rab4A（Z=3.580、3.570，均P＜0.001）和Rab14 mRNA（Z=3.582、3.578，均P＜0.001）表達水平均顯著降低。空白對照組和青霉素對照組中Rab4A和 Rab14 mRNA表達水平差異無統計學意義（Z= 1.46、1.94，均P＞0.05）。見表1。

表1 Rab蛋白家族在沙眼衣原體感染各組McCoy細胞中的蛋白表達水平和轉錄水平表達的比較［中位數（P25～P75）］

討論

Rab蛋白是GTPases的Ras超家族成員之一，Rab GTPases被命名為小G蛋白，已經發現的Rab蛋白有70多種［5-6］，如Rab4（Rab4A和Rab4B）、Rab6（Rab6A和Rab6B）、Rab10、Rab11（Rab11A和Rab11B）、Rab14等。Rab蛋白家族在多個步驟中調節膜的轉運，包括在供膜上形成轉運囊泡，運輸和對接囊泡，在受膜上融合囊泡，是囊泡運輸的調控者。衣原體表達并分泌特定的Rab結合蛋白到包涵體膜上［7-8］。已有研究表明，Rab4和Rab11出現在所有種屬的衣原體包涵體膜上，Rab6和Rab10也㈦某些種屬的衣原體包涵體密切相關［9］。Rab6A和Rab11A可調節、控制衣原體的生長，抑制Rab6A或Rab11A的表達會抑制衣原體急性感染所導致的McCoy細胞高爾基體片段化，并隨衣原體的增殖減少和脂類物質運輸減少［10］。涉及高爾基體反面網狀結構向內吞泡和細胞膜系統運輸的Rab14被發現出現在衣原體包涵體膜上，研究提示，Rab14幫助鞘磷脂從高爾基體向衣原體包涵體轉運［11］。然而，目前衣原體持續感染狀態下Rab蛋白家族表達的相關研究還很少。

已有研究表明，急性感染狀態下衣原體包涵體通過攔截高爾基反面網狀結構來源的運輸囊泡［2，12-14］及多囊泡小體［15-16］，即通過囊泡運輸途徑和高爾基體片段化獲取脂類物質，以保證自身的復制和生存。衣原體持續感染㈦衣原體急性感染特點不同，如結構異常、生活周期改變、代謝減慢、生物合成減少等。未規范治療的Ct感染在生殖泌尿道引起的慢性炎癥，特別是慢性盆腔炎、異位妊娠以及輸卵管性不孕等，均㈦Ct在這些部位的持續感染有關。標準方案治療后有高達8%的失敗率［17］，而治療失敗的病例不僅引起持續感染，還會增加發生以上并發癥的概率，并使Ct感染在人群中繼續傳播［18］。本課題組已經對比研究了Ct持續感染㈦急性感染狀態下McCoy細胞高爾基體的形態結構，發現在Ct持續感染狀態下McCoy細胞高爾基體片段化受到顯著抑制［4］。而本研究結果顯示，Ct持續感染狀態下，不僅在蛋白表達水平，5種Rab蛋白的含量明顯高于急性感染狀態，而且在基因轉錄水平，Rab4A和Rab14 mRNA的表達均高于急性感染狀態。此兩種蛋白㈦McCoy細胞的脂質運輸和高爾基體結構密切相關。這不僅㈦我們的前期［4］研究結果相吻合，更印證了持續感染的Ct代謝減慢、生物合成減少的特點。我們推測，McCoy細胞Rab蛋白的降解在Ct持續感染狀態下較急性感染明顯降低的原因是持續感染的Ct對營養物質尤其脂類物質的需求減少，因此從McCoy細胞獲取營養的囊泡運輸途徑也較急性感染狀態明顯減少。這㈦Ct持續感染下McCoy細胞高爾基體片段化明顯受到抑制是一致的，共同反⒊出持續感染的Ct代謝減弱、合成減少的特點。

本研究為Ct持續感染的發生機制積累了資料，Rab蛋白可能可以作為鑒別Ct急性感染㈦持續感染的指標，但尚需在動物模型及患者血清標本中檢測核實。目前治療Ct的藥物基本是針對病原體結構，但對持續感染效果不佳。本研究結果也為抗衣原體感染狀態的治療提供了一種新思路，即可以考慮通過干擾高爾基體的功能或阻斷McCoy細胞通過Rab蛋白的囊泡轉運來控制衣原體感染。

［1］Elwell CA,Engel JN.Lipid acquisition by intracellularChlamydiae［J］.Cell Microbiol,2012,14（7）:1010-1018.DOI:10.1111/j. 1462-5822.2012.01794.x.

［2］Hackstadt T,Scidmore MA,Rockey DD.Lipid metabolism in Chlamydia trachomatis-infected cells:directed trafficking of Golgiderived sphingolipids to the chlamydial inclusion［J］.Proc Natl Acad Sci USA,1995,92（11）:4877-4881.

［3］Heuer D,Rejman Lipinski A,Machuy N,et al.Chlamydiacauses fragmentation of the Golgi compartment to ensure reproduction［J］. Nature,2009,457（7230）:731-735.DOI:10.1038/nature07578.

［4］Zhu H,Li H,Wang P,et al.Persistent and acute chlamydial infectionsinducedifferentstructuralchangesin theGolgi apparatus［J］.Int J Med Microbiol,2014,304（5-6）:577-585.DOI: 10.1016/j.ijmm.2014.03.002.

［5］Pfeffer S,Aivazian D.Targeting Rab GTPases to distinct membrane compartments［J］.Nat Rev Mol Cell Biol,2004,5（11）:886-896. DOI:10.1038/nrm1500.

［6］Stenmark H.Rab GTPases as coordinators of vesicle traffic［J］.Nat Rev Mol Cell Biol,2009,10（8）:513-525.DOI:10.1038/nrm2728.

［7］Cortes C,Rzomp KA,Tvinnereim A,et al.Chlamydia pneumoniae inclusion membrane protein Cpn0585 interacts with multiple Rab GTPases［J］.Infect Immun,2007,75（12）:5586-5596.DOI: 10.1128/IAI.01020-07.

［8］Rzomp KA,Moorhead AR,Scidmore MA.The GTPase Rab4 interacts withChlamydia trachomatisinclusion membrane protein CT229［J］.Infect Immun,2006,74（9）:5362-5373.DOI:10.1128/ IAI.00539-06.

［9］Rzomp KA,Scholtes LD,Briggs BJ,et al.Rab GTPases are recruited to chlamydial inclusions in both a species-dependent and species-independent manner［J］.Infect Immun,2003,71（10）: 5855-5870.DOI:10.1128/IAI.71.10.5855-5870.2003.

［10］Rejman Lipinski A,Heymann J,Meissner C,et al.Rab6 and Rab11 regulate Chlamydiatrachomatisdevelopmentand golgin-84-dependent Golgi fragmentation［J］.PLoS Pathog,2009,5（10）: e1000615.DOI:10.1371/journal.ppat.1000615.

［11］Al-Zeer MA,Al-Younes HM,Kerr M,et al.Chlamydia trachomatis remodels stable microtubules to coordinate Golgi stack recruitment to the chlamydial inclusion surface［J］.Mol Microbiol,2014,94（6）:1285-1297.DOI:10.1111/mmi.12829.

［12］Hackstadt T,Rockey DD,Heinzen RA,et al.Chlamydia trachomatisinterrupts an exocytic pathway to acquire endogenously synthesized sphingomyelin in transit from the Golgi apparatus to the plasma membrane［J］.EMBO J,1996,15（5）:964-977.

［13］Carabeo RA,Mead DJ,Hackstadt T.Golgi-dependent transport of cholesterol to theChlamydia trachomatisinclusion［J］.Proc Natl Acad Sci USA,2003,100（11）:6771-6776.DOI:10.1073/pnas. 1131289100.

［14］Moore ER,Fischer ER,Mead DJ,et al.The chlamydial inclusion preferentially intercepts basolaterally directed sphingomyelincontaining exocytic vacuoles［J］.Traffic,2008,9（12）:2130-2140. DOI:10.1111/j.1600-0854.2008.00828.x.

［15］Robertson DK,Gu L,Rowe RK,et al.Inclusion biogenesis and reactivation of persistentChlamydia trachomatisrequires host cell sphingolipid biosynthesis［J］.PLoS Pathog,2009,5（11）: e1000664.DOI:10.1371/journal.ppat.1000664.

［16］ Beatty WL.Trafficking from CD63-positive late endocytic multivesicular bodies is essential for intracellular development of Chlamydia trachomatis［J］.J Cell Sci,2006,119（Pt 2）:350-359. DOI:10.1242/jcs.02733.

［17］Golden MR,Whittington WL,Handsfield HH,et al.Effect of expedited treatment of sex partners on recurrent or persistent gonorrhea or chlamydial infection［J］.N Engl J Med,2005,352（7）:676-685.DOI:10.1056/NEJMoa041681.

［18］Hocking JS,Vodstrcil LA,Huston WM,et al.A cohort study of Chlamydia trachomatistreatment failure in women:a study protocol［J］.BMC Infect Dis,2013,13:379.DOI:10.1186/1471-2334-13-379.

Differences in Rab protein expressions in McCoy cells with acute versus persistentChlamydia trachomatis infection

Ma Chunguang,Zhu Huiling,Zhang Xinyue,Chen Mukai,Han Jiande

Department of Dermatology,First Affiliated Hospital,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510080,China（Ma CG,Zhang XY,Chen MK,Han JD）;Department of Dermatology,First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University,Guangzhou 510120,China（Zhu HL）

ObjectiveTo investigate differences in Rab protein expressions in McCoy cells with acute versus persistentChlamydia trachomatis（Ct）infection.MethodsCultured McCoy cells were infected with different amounts（400,500,550 μl/well）of Ct strain D suspensions,then cultured with the medium containing 100 U/ml penicillin G（persistent Ct infection groups）or that without penicillin G （acute Ct infection groups）.Ct-uninfected McCoy cells receiving no penicillin G treatment served as the blank control group,and those receiving penicillin G treatment as the penicillin group.After 48-hour culture,McCoy cells were lysed,proteins were collected,and total RNA was extracted from the cells.Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）was conducted to measure protein levels of Rab4A,Rab6A, Rab10,Rab11A and Rab14,and fluorescence-based quantitative PCR to quantify mRNA expressions of Rab4A and Rab14（expressed as 2-ΔΔCt）.ResultsProtein levels of Rab4A,Rab6A,Rab10,Rab11A and Rab14 were all significantly lower in the acute than in the persistent Ct infection groups（allZ=3.621,P＜0.001）,and lower in the persistent and acute Ct infection groups than in the blank control group（allP＜0.008 3）,but insignificantly different between the blank control group and penicillin group（allP＞0.05）.In addition,the expressions of Rab4A and Rab14 mRNAs were consistent with those of their proteins in these groups.Conclusion The transcriptional and expression levels of Rab proteins are higher in McCoy cells persistently infected with Ct than in those acutely infected with Ct.

Chlamydia trachomatis;Chlamydiainfections;rab GTP-binding proteins;Acute infection;Persistent infection;McCoy cells

Han Jiande,Email:hanjd_gzb@21cn.net

韓建德，Email：hanjd_gzb@21cn.net

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.05.009

國家自然科學基金（81071404）；廣東省自然科學基金（S2013010015360）；廣州市科技計劃項目（2014J4100178）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（81071404）;Natural Science Foundation of Guangdong Province of China（S2013010015360）;Science and Technology Planning Project of Guangzhou（2014J4100178）

2015-07-01）

（本文編輯：周良佳 顏艷）