蛭丹化瘀組方制劑的質量研究

劉怡，李任，王麗麗，沈素

（首都醫科大學附屬北京友誼醫院，北京100050）

蛭丹化瘀組方制劑的質量研究

劉怡，李任，王麗麗，沈素

（首都醫科大學附屬北京友誼醫院，北京100050）

目的建立同時測定中藥制劑蛭丹化瘀組方中芍藥苷、阿魏酸、丹皮酚和芒柄花素含量的反相高效液相色譜（RP-HPLC）法，并探討口服液、配方顆粒和浸膏劑的質量差異。方法色譜柱采用Kromasil 100-5 C18柱（150 mm×4.6 mm，5 m）；流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫；上述4種活性成分檢測波長分別為230，320，274，248 nm；流速1.5 mL/min。結果芍藥苷在進樣量為0.5～5.0 g范圍內與峰面積線性關系良好（n=5）；阿魏酸、丹皮酚和芒柄花素在進樣量為0.04～0.4 g范圍內與峰面積線性關系良好（n=5）；各成分加樣回收率分別為98.92%，96.47%，98.93%，102.48%（RSD=1.54，1.15，1.42，1.97，n=6）；3種蛭丹化瘀組方制劑中各有效成分含量不同。結論該法可用于蛭丹化瘀組方制劑的質量控制，不同工藝可能導致制劑中有效成分含量的差異。

蛭丹化瘀方；芍藥苷；阿魏酸；芒柄花素；丹皮酚；含量測定；高效液相色譜法

蛭丹化瘀口服液是首都醫科大學附屬北京友誼醫院的醫院制劑，適用于氣血凝滯造成的肺絡痹阻［1-2］。臨床用于治療小兒病毒性肺炎30余年，可有效促進患兒咳嗽、咳痰等癥狀的好轉，加快肺部羅音或水泡音的吸收，可有效縮短患兒住院時間，且安全性良好，是輔助治療小兒病毒性肺炎的理想藥物。蛭丹化瘀組方由牡丹皮、當歸、赤芍、雞血藤和川芎等7味中藥組成，曾采用薄層色譜法進行對照試驗，無法進行定量測定。本研究中參考文獻［3-5］，建立了蛭丹化瘀配方顆粒中芍藥苷、阿魏酸、丹皮酚、芒柄花素4種成分含量的反相高效液相色譜（RP-HPLC）法測定方法，該方法專屬性好、靈敏度高，并對蛭丹化瘀口服液、配方顆粒和浸膏劑中上述4種有效成分進行含量測定，為探討蛭丹化瘀配方組方的質量控制、確保患者用藥的安全有效提供研究基礎。

1　儀器與試藥

1.1儀器

Agilent 1100型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；TP 300型超聲波提取器（天鵬電子新技術北京有限公司）；JA1003型電子分析天平（上海精科天平儀器廠）；Milli-Q Integral型超純水儀（密理博中國有限公司）。

1.2試劑

蛭丹化瘀口服液、配方顆粒和浸膏劑樣品由首都醫科大學附屬北京友誼醫院藥學部提供；對照品芍藥苷（批號為110736-201438，純度96.4%）、阿魏酸（批號為110773-201012，純度98%）、丹皮酚（批號為110708-201407，純度99.9%）、芒柄花素（批號為111703-200603，純度96.4%），均購于中國食品藥品檢定研究院。乙腈、甲醇為色譜級試劑，均購自默克股份有限公司；甲酸（分析純試劑，國藥集團化學試劑有限公司）。

2　方法與結果

2.1色譜條件

色譜柱：Kromasil 100-5 C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫，0～10 min 85%B，10～15 min 76%B，15～20 min 70%B，20～30 min 50%B；檢測波長：0～8 min 230 nm，8～12 min 320 nm，12～26 min 274 nm；26～30 min 248 nm；流速：1.5 mL/min；柱溫：30℃；進樣量：10 μL。2.2溶液制備

對照品溶液：分別精密稱取阿魏酸、芒柄花素和丹皮酚對照品各10 mg，置100 mL容量瓶中，甲醇溶解定容，得質量濃度為100 μg/mL阿魏酸、芒柄花素、丹皮酚混合對照品母液；精密稱取芍藥苷25 mg，置50 mL容量瓶中，甲醇溶解定容，得質量濃度為500 μg/mL的芍藥苷對照品母液；精密移取阿魏酸、芒柄花素和丹皮酚對照品母液2 mL，芍藥苷對照品母液5 mL，置10 mL容量瓶中，甲醇定容，得到阿魏酸、芒柄花素和丹皮酚質量濃度均為20 μg/mL，芍藥苷質量濃度為250 μg/mL的對照品溶液。

供試品溶液：取相當于22 g原藥材的配方顆粒，置25 mL容量瓶中，加入適量甲醇，超聲提取30 min，放置至室溫，加入甲醇定容，適當稀釋后過0.45 μm濾膜，得到供試品溶液。

陰性對照品溶液：以配方顆粒為例，取去除當歸、川芎的配方顆粒，置25 mL容量瓶中，加入適量甲醇超聲提取30 min，放置至室溫，加入甲醇定容，過0.45 μm濾膜，得阿魏酸陰性對照品溶液。以配方顆粒為例，取去除牡丹皮、赤芍的配方顆粒，置25 mL容量瓶中，加入適量甲醇超聲提取30 min，放置至室溫，加入甲醇定容，過0.45 μm濾膜，得芍藥苷、丹皮酚陰性對照品溶液。以配方顆粒為例，取去除雞血藤、黃芪的配方顆粒，置25 mL容量瓶中，加入適量甲醇超聲提取30 min，放置至室溫，加入甲醇定容，過0.45 μm濾膜，得芒柄花素陰性對照品溶液。

2.3方法學考察

專屬性考察：精密吸取陰性對照品溶液、對照品溶液、供試品溶液各10 μL，按照擬訂色譜條件進樣測定。結果配方顆粒陰性對照品溶液對供試品溶液的測定無干擾，各待測成分分離良好，表明方法專屬性良好。色譜圖見圖1。

標準曲線繪制：分別精密吸取芍藥苷、阿魏酸、丹皮酚和芒柄花素對照品溶液2，5，10，15，20 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積。以峰面積（Y）為縱坐標、進樣量（X，μg）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程。芍藥苷為Y=1 048.2X+52.805，r2=0.999 3；阿魏酸為Y= 3 303.4 X-1.5122，r2=1；芒柄花素為Y=4 036.9 X+ 0.122，r2=0.999 6；丹皮酚為Y=4 198.2 X+0.780 5，r2=1。結果表明，芍藥苷在進樣量為0.5～5.0 μg范圍內與峰面積線性關系良好（n=5）；阿魏酸、丹皮酚和芒柄花素在進樣量為0.04～0.4 μg范圍內與峰面積線性關系良好（n=5）。

精密度試驗：精密吸取同一對照品溶液10 μL，連續進樣6次，記錄峰面積并計算精密度。以配方顆粒為例，結果芍藥苷、阿魏酸、丹皮酚和芒柄花素峰面積的RSD分別為0.6%，0.3%，0.1%和0.1%（n=6），表明儀器精密度良好。

圖1　高效液相色譜圖

穩定性試驗：依法配制成供試品溶液，分別于0，6，12，24 h時進樣10 μL，依法測定。以配方顆粒為例，結果供試品溶液中芍藥苷、阿魏酸、丹皮酚和芒柄花素峰面積的RSD分別為1.4%，1.2%，1.3%，1.3%（n=6），表明供試品溶液在24 h內穩定。

重復性試驗：精密吸取2.2項下同一供試品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，計算供試品溶液中芍藥苷、阿魏酸、丹皮酚和芒柄花素的含量。以配方顆粒為例，結果4種成分的RSD分別為1.2%，0.3%，0.5%和0.8%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：精密吸取6份已知含量的供試品溶液，分別精密加入適量芍藥苷、阿魏酸、丹皮酚和芒柄花素對照品溶液，甲醇定容后精密吸取10 μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖并計算回收率。以配方顆粒為例，結果見表1。

2.4樣品含量測定

精密量取蛭丹化瘀口服液、配方顆粒和浸膏劑，依法制備供試品溶液，精密移取10 μL，注入高效液相色譜儀測定，記錄峰面積，以外標法計算樣品中各成分含量。結果見表2。

3　討論

3.1活性成分選擇

芍藥苷是赤芍中活性成分，具有改善微循環、抗氧化等多種生物學效應，且毒副作用較小［6］。阿魏酸是川芎和當歸中的活性成分，具有很好的抗血栓、抗菌消炎的作用［7］。丹皮酚是牡丹皮中活性成分，具有活血、促進微循環、增強免疫等作用［8］。芒柄花素是雞血藤中活性成分，可以有效減輕炎癥因子對氣道上皮細胞損害［9］。上述活性成分均可能有助于炎癥的好轉和恢復，并為赤芍等中藥材的指標成分，故選擇此4種活性成分作為指標以對蛭丹化瘀組方進行質量研究。

3.2質量差異原因

表1　加樣回收試驗結果（n=6）

表2　3種蛭丹化瘀組方制劑中芍藥苷、阿魏酸、芒柄花素和丹皮酚含量測定結果（±s，n=3）

表2　3種蛭丹化瘀組方制劑中芍藥苷、阿魏酸、芒柄花素和丹皮酚含量測定結果（±s，n=3）

注：mg/g及 g/g為相當于每1 g生藥中含待測物量；每10 mL口服液、3.77 g配方顆粒和4.5 mL浸膏劑相當于22 g生藥；-為含量低于4.55 g/g。

制劑配方顆粒口服液（批號為1 5 1 1 0 1）浸膏劑芍藥苷（m g / g）1 . 4 5 ± 0 . 0 2 1 . 3 2 ± 0 . 0 1 3 . 4 8 ± 0 . 0 1阿魏酸（ g / g）2 9 . 3 5 ± 1 . 3 1 8 . 7 5 ± 0 . 5 0 6 5 . 7 7 ± 0 . 5 1丹皮酚（ g / g）2 1 . 0 1 ± 1 . 7 2 -4 8 3 . 9 4 ± 4 . 9 9芒柄花素（ g / g）6 . 8 3 ± 0 . 3 2 --

由表2可知，與蛭丹化瘀口服液相比，配方顆粒中阿魏酸、丹皮酚和芒柄花素的含量均高于口服液制劑，說明將蛭丹化瘀口服液按照組方比例制備成配方顆粒后，該4種有效成分均有不同程度的提高。體外抗呼吸道合胞（RSV）試驗證明，配方顆粒與蛭丹化瘀口服液具有相同的抗病毒活性［10］。另外，配方顆粒還可克服口服液普遍存在相對生產成本較高、工藝復雜、運輸貯存不便等缺點，提高醫院制劑效率。浸膏劑中丹皮酚含量遠高于其他兩種制劑，這是因為浸膏制備過程中，首先采用蒸餾法提取了牡丹皮中的丹皮酚，采用β-環糊精將丹皮酚包合在其筒狀結構中，有效地提高了揮發性成份丹皮酚的濃度和穩定性。包合物技術可以有效提高中藥揮發油性成份在制劑中的含量和穩定性，在一定程度上提高制劑的質量和療效。

3.3缺點與不足

蛭丹化瘀組方中還包括黃芪，黃芪甲苷為其重要活性成分，在減少炎癥物質的產生、清除氧自由基和抗病毒等方面具有良好活性［11］。對組方中的黃芪甲苷進行含量測定，可進一步對該組方的質量進行有效研究和控制，但黃芪甲苷紫外吸收在210 nm波長附近，末端吸收影響較大，難以采用高效液相色譜-紫外檢測器（HPLC-UV）方法進行測定，在未來研究中擬采用高效液相色譜-蒸發光散射檢測器（HPLC-ELSD）法對黃芪甲苷的含量進行測定，從而進一步研究蛭丹化瘀不同制劑的質量差異和質量控制。

本試驗中首次建立了RP-HPLC法同時測定芍藥苷、阿魏酸、丹皮酚和芒柄花素的含量測定方法，該方法可用于蛭丹化瘀組方的質量研究，簡單便捷、準確可靠。蛭丹化瘀配方顆粒和浸膏劑均能不同程度地提高芍藥苷等有效成分在制劑中的含量，對于改進劑型、提高蛭丹化瘀組方療效具有積極意義。

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Quality Study of Zhidan Huayu Preparation

Liu Yi，Li Ren，Wang Lili，Shen Su
（Beijing Friendship Hospital Affiliated to Capital Medical University，Beijing，China100050）

ObjectiveTo establish an RP-HPLC method for the simultaneous content determination of paeoniflorin，ferulic acid，paeonol and formononetin in Zhidan Huayu Prescription，and to investigate the quality differences among oral liquid，particle formulation and extract of Zhidan Huayu Prescription.M ethodsThe Kromasil 100-5 C18column was used.Gradient elution was developed.The detection wavelength was at 230，320，274 and 248 nm for the above 4 components.The flow rate was 1.5 mL/min.ResultsThe method was specific，accurate and sensitive for the content determination of the 4 components.The content of these components were different in oral solution，concreteand compatiblegranule.ConclusionTheRP-HPLCmethod can beused for quality controlof Zhidan Huayu Prescription.Different preparation process may affect the quality the effective component in the prescription.

Zhidan Huayu Prescription；herbaceous peony；ferulic acid；paeonol；formononetin；content determination；HPLC

R284.1；R286

A

1006-4931（2016）15-0024-04

北京市科學技術委員會“十病十藥”研發項目，項目編號：Z141100002214019。

劉怡（1984-），女，博士研究生，藥師，研究方向為臨床藥學，（電話）010-63138510（電子信箱）woshi_yybb@163.com；沈素（1961-），女，大學本科，主任藥師，研究方向為醫藥管理和臨床藥學，本文通訊作者，（電子信箱）shensu11022000@163.com。

（2016-03-22）