武當(dāng)山區(qū)不同品種重樓地上部分總黃酮含量比較研究

楊金霞，朱敏，葉方，陳黎，黃良永，孫良學(xué)，雷攀

（1.湖北省十堰市太和醫(yī)院·湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院，湖北十堰442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院湖北省藥用植物綜合利用工程技術(shù)研究中心，湖北十堰442000；3.湖北濟(jì)世藥業(yè)有限責(zé)任公司，湖北十堰442000）

武當(dāng)山區(qū)不同品種重樓地上部分總黃酮含量比較研究

楊金霞1，2，朱敏2，葉方1，2，陳黎1，2，黃良永1，2，孫良學(xué)3，雷攀1，2

（1.湖北省十堰市太和醫(yī)院·湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院，湖北十堰442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院湖北省藥用植物綜合利用工程技術(shù)研究中心，湖北十堰442000；3.湖北濟(jì)世藥業(yè)有限責(zé)任公司，湖北十堰442000）

目的建立測(cè)定武當(dāng)山區(qū)不同品種野生轉(zhuǎn)家種重樓地上部分總黃酮含量的熒光分光光度法。方法以蘆丁為對(duì)照品，激發(fā)波長(zhǎng)445 nm、發(fā)射波長(zhǎng)484 nm、狹縫寬度2.5 nm，測(cè)定總黃酮含量。結(jié)果與結(jié)論不同品種重樓地上部分總黃酮含量差異較大，其中多葉重樓含量較高，滇重樓最低，宜選擇多葉重樓地上部分進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用。

重樓；總黃酮；野生轉(zhuǎn)家種；地上部分

重樓為百合科Liliaceae重樓屬Paris L.多年生草本植物，又名蚤休、七葉一枝花、草河車(chē)，具有消腫止痛、抗癌、清熱解毒和止血等作用，廣泛用于多種中藥制劑中，是宮血寧、紅藥、熱毒清等重要中成藥的主要成分。重樓為多年生草本，對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求較為苛刻，適合生長(zhǎng)在海拔600～3 100 m、雨量充沛、氣候涼爽、腐殖質(zhì)豐富的環(huán)境下［1］。武當(dāng)山區(qū)地理氣候環(huán)境獨(dú)特，適于重樓等藥用植物的生長(zhǎng)［2］。黃酮類(lèi)成分對(duì)心血管、抗肝損傷、解痙、呼吸系統(tǒng)可起良好作用，有雌激素樣作用，可抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化作用，在醫(yī)藥、食品保健等方面已被廣泛應(yīng)用［3-4］。重樓的傳統(tǒng)用藥部分為地下根莖，而地上部分常棄去，造成資源浪費(fèi)。本研究中測(cè)定并比較了重樓不同品種間地上部分總黃酮含量的變化，以期為重樓地上部分資源的合理利用提供參考。

1　儀器與試藥

1.1儀器

日立F-7000型熒光光譜儀；FA-2004型電子分析天平（上海精密儀器）；PHSJ-A型數(shù)字式酸度計(jì)（上海雷磁儀器）；HW1A型電熱恒溫水浴箱（北京醫(yī)療設(shè)備廠）。

1.2試藥

蘆丁對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為100080-201408，含量92.8%）；重樓藥材采自武當(dāng)山區(qū)馬家河龍王寨，原藥材地上部分洗凈，50℃烘干，粉碎過(guò)3號(hào)篩備用，由湖北醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院葉方副教授鑒定，樣本保存在湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市太和醫(yī)院藥學(xué)部標(biāo)本室，見(jiàn)表1。無(wú)水乙醇、石油醚、硝酸鋁、醋酸鈉、冰乙酸均為分析純；水為自制去離子水。

表1　樣品基源信息及含量測(cè)定結(jié)果

2　方法與結(jié)果

2.1溶液制備

精密稱(chēng)取10.3 mg蘆丁對(duì)照品于50 mL容量瓶中，用60%的乙醇溶液定容至刻度，得對(duì)照品溶液。

精密稱(chēng)定不同品種及不同采收期重樓的地上部分干燥粉末1.0 g，置100 mL錐形瓶中，加入25 mL石油醚，放入60℃恒溫水浴鍋水浴回流2 h，棄石油醚液后將藥渣揮干，加入30 mL 60%乙醇，再放入80℃恒溫水浴鍋回流2 h，濾過(guò)，用60%乙醇將容器和藥渣沖洗3次，合并濾液，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，加入60%乙醇定容至刻度［5］，得到供試品溶液A1～A12。

2.2檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

精密量取蘆丁對(duì)照品0.5 mL，置10 mL容量瓶中，加入1 mL 10%硝酸鋁溶液及3 mL pH=4的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液后，加60%乙醇定容至刻度［6］，搖勻，放置25 min［7］。精密量取A1樣品溶液0.5 mL，置10 mL容量瓶中，同上述操作。取上述對(duì)照品及供試品溶液進(jìn)行激發(fā)光譜（λex）和發(fā)射光譜（λem）波長(zhǎng)掃描：固定λex，掃描λem在200～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)蘆丁對(duì)照品及供試品溶液熒光強(qiáng)度，結(jié)果最佳λem為484 nm。見(jiàn)圖1A和圖1B。固定λem為484，掃描λex在200～700 nm范圍內(nèi)蘆丁對(duì)照品及樣品溶液熒光強(qiáng)度，結(jié)果最佳λex為445 nm，見(jiàn)圖1C和圖1D。本試驗(yàn)選擇確定熒光條件為：λex為445 nm，λem為484 nm，狹縫寬度為2.5 nm。

2.3方法學(xué)考察

圖1　熒光分光光度色譜圖

線性關(guān)系考察：精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液0，0.1，0.2，0.4，0.8，1.6 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加入10%硝酸鋁溶液1 mL，pH=4的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液3 mL，加60%乙醇定容至刻度，搖勻，放置25 min。按擬訂熒光條件對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行熒光強(qiáng)度檢測(cè)；以60%乙醇溶液作空白，同法操作，測(cè)定吸光度值。以標(biāo)準(zhǔn)品溶液質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，Δ吸光度值（吸光度值-空白）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=0.019 0 X+0.038 5，R2=0.996 8（n=6）。結(jié)果表明，蘆丁質(zhì)量濃度在2.06～32.96 μg/mL范圍內(nèi)與熒光強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱(chēng)取7號(hào)藥材粉末1 g，共6份，分別精密吸取0.5 mL置10 mL容量瓶中，按2.3項(xiàng)下方法與硝酸鋁顯色后，在擬訂熒光法條件下測(cè)定光度值，計(jì)算總黃酮含量。結(jié)果樣品平均含量為0.59%，RSD值為2.13%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液1 mL，置10 mL容量瓶中，按2.3項(xiàng)下方法顯色后，在擬訂熒光條件下測(cè)定光度值，在0，0.5，1.0，1.5，2.0 h時(shí)測(cè)定吸光度。結(jié)果的RSD為1.28%（n=5），表明供試品溶液在2 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取1 mL蘆丁對(duì)照品溶液置10 mL容量瓶中，按2.3項(xiàng)下方法顯色后，在擬訂熒光條件下連續(xù)測(cè)定光度值。結(jié)果5次光度值數(shù)據(jù)的RSD值為1.97%（n=5），表明儀器精密度良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密稱(chēng)取同一批次7號(hào)藥材粉末0.5 g，共計(jì)6份，按2.2項(xiàng)下方法用石油醚除去葉綠素后，分別精密加入5 mL蘆丁對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為0.612 0 g/L，加60%乙醇回流提取后過(guò)濾，藥渣沖洗3次，合并濾液至50 mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻，按2.3項(xiàng)下方法顯色，在擬訂熒光條件下測(cè)定吸光度值，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.4樣品含量測(cè)定

在擬訂熒光條件下，按2.3項(xiàng)下方法與硝酸鋁顯色后，測(cè)定樣品中總黃酮的光度值，計(jì)算樣品中總黃酮的含量。結(jié)果見(jiàn)表1。

3　討論

重樓是多年生藥用植物，塊莖繁殖需4～5年采收，種子繁殖需要8～9年采收，生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)。人工種植重樓時(shí)，為了讓養(yǎng)分集中供應(yīng)根莖部位以利生長(zhǎng)，一般在5～6月花萼片展開(kāi)后，及時(shí)剪去全部花花薹，以提高產(chǎn)量［8-9］。如此一來(lái)地上部分均被浪費(fèi)，在野生資源日趨緊張的大環(huán)境下，有必要開(kāi)展藥材新資源的研究［10］。由表可知，武當(dāng)山區(qū)家種多葉重樓地上部分總黃酮含量高，建議取多葉重樓地上部分為原料提取黃酮，以擴(kuò)大其臨床用藥的藥源的經(jīng)濟(jì)意義。

品種選擇：由表1可知，不同品種重樓地上部分總黃酮含量差異較大。其中多葉重樓、寬葉重樓、狹葉重樓總黃酮含量較高，華重樓、滇重樓含量較低。2015年版《中國(guó)藥典（一部）》規(guī)定，華重樓和滇重樓為正品重樓，以重樓皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ，Ⅶ4種成分作為質(zhì)量控制指標(biāo)，前期研究證明華重樓和滇重樓中皂苷含量較高，多葉重樓、寬葉重樓中皂苷類(lèi)成分較低，表明重樓中黃酮類(lèi)成分與皂苷類(lèi)成分可能存在負(fù)相關(guān)，建議宜選用多葉重樓、寬葉重樓等品種開(kāi)發(fā)重樓中黃酮類(lèi)成分。

熒光分光光度法測(cè)定總黃酮含量：根據(jù)黃酮類(lèi)化合物能與鋁離子反應(yīng)形成熒光螯合物的原理，可采用熒光光度法測(cè)定藥用植物中總黃酮的含量［7］。本研究中盡管在樣品處理過(guò)程中采用石油醚去除葉綠素，但可能還是會(huì)干擾對(duì)黃酮含量的測(cè)定。采用硝酸鋁在酸性條件下與樣品中黃酮類(lèi)成分產(chǎn)生熒光物質(zhì)的原理，用熒光分光光度法測(cè)定總黃酮含量，專(zhuān)屬性高。

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Comparative Study on Content of Total Flavonoids from the Aerial Parts of Different Varietals Paris from WuDang M ountain Area

Yang Jinxia1，2，Zhu Min2，Ye Fang1，2，Chen Li1，2，Huang Liangyong1，2，Sun Liangxue3，Lei Pan1，2
（1.Shiyan Taihe Hospital·Hubei University of Medicine，Shiyan，Hubei，China442000；2.Engineering Research Center for Herbal Utilization of Hubei Province，Hubei University of MedicineHubei University of Medicine，Shiyan，Hubei，China442000；3.Hubei Jishi Pharmaceutical Co.，Ltd.，Shiyan，Hubei，China442000）

ObjectiveTo compare the content of total flavonoids from the aerial parts of different varietals Paris from WuDang mountain area.M ethodsRutin was used as contrast calibre，for the excitation wavelength of λex=445 nm，emission wavelength of λem=484 nm，slitwidth 2.5nm，and contentof totalflavonoidswasdetermined by usingfluorescencespectrophotometricmethod.Resultsand ConclusionThe content of total flavonoids in the aerial parts of different varietals Paris varied in different regions，and it was the highest in Paris polyphylla Sm.，and was lowest in Paris polyphylla Sm.var.yunnanensis.To exploit and use the aerial parts，it is better to select the Paris polyphylla Sm.

Paris；total flavonoids；cultivated from wild；aerial parts

R284.1；R282.71

A

1006-4931（2016）15-0016-03

湖北省2011計(jì)劃，項(xiàng)目編號(hào)：4；2014年湖北省中青年創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)：T201414；湖北省藥用植物綜合利用工程技術(shù)研究中心項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)：GC2015204。

楊金霞（1974-），女，大學(xué)本科，主管藥師，研究方向?yàn)獒t(yī)院藥學(xué)，（電子信箱）236172734@ qq.com；陳黎（1973-），女，博士研究生，主任藥師，主要從事醫(yī)院藥事管理與中藥研發(fā)工作，本文通訊作者，（電子信箱）chenli0201@sina.com。

（2016-04-22）